Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

<p class="jove_content"<strong> Materiali richiesti:</strong> Dissection stereo-microscopio, su due lati del nastro, vetrino da microscopio standard e coprioggetti, pinze dissezione (dimensione 5 o 5,5), spazzola a setole morbide, vuoto grasso al silicone, siringa da 5 cc, carta Whatman, confocale o microscopio a epifluorescenza con fotocamera digitale e immagine acquisizione del software.</p><p class="jove_title"> 1. Dissezione pupa</p><ol><li> Impostare una croce (con la combinazione appropriata di GAL4 linea e un tag proteina di fusione GFP sotto controllo SUP) o vola posto da uno stock che si desidera immagine in diverse fiale fresco a 25 ° C.</li><li> Cellule SOP generalmente cominciano a proliferare sul torace pupa a diciotto ore dopo l'insorgenza di pupariation, abbiamo quindi selezionare pupe "bianco" dallo stock volare appropriato o croce. Bianco pupe hanno la morfologia pupa, ma hanno un caso non pigmentato pupa, che indica che che hanno pupariated entro un'ora.</li><li> Attendere circa 18 ore.</li><li> Posizionare un pezzo di nastro biadesivo sul vetrino. Raccogliere pupe e rispettare il caso pupa al nastro biadesivo con il lato ventrale verso il basso. Afferrare il bordo dell'opercolo (il portello circolare sulla punta anteriore dorsale del caso pupa) con la pinza</li><li> Sollevare delicatamente, rimuovere ed eliminare l'opercolo, rivelando la testa della mosca immaturo.</li><li> Usa le pinze per iniziare a strappi lungo il lato del case pupa. Sollevare la parte mediana del caso pupa dal lato strappato e portarlo verso il lato opposto, o rimuoverla completamente o allegarlo al nastro, rivelando la parte anteriore del torace e dell'addome. (<strong> Nota</strong>: C'è un divario tra il volano di sviluppo e il caso pupa. Fare attenzione a non forare il volo come la parete della cassa è strappata.)</li><li> Inizia taglio lungo lo stesso lato della cassa pupa verso la fine posteriore. Ancora una volta, fare attenzione a non forare il volo. Tirare il caso pupa sul lato opposto della mosca e premerlo sul nastro biadesivo. L'addome dovrebbe ora essere completamente esposti. Posizionare la spazzola a setole morbide direttamente sotto la testa della mosca. Una volta che il volo è bloccato al pennello e libero del caso pupa, usare la spazzola per sollevare delicatamente il volano via della diapositiva.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Pupa di montaggio</p><p class="jove_content"> Dopo la dissezione, pupe vengono poi montati tra vetrino e coprioggetto:</p><ol start="8"><lipupe> Isolato rimosso dal caso possono poi essere immessi sul centro di un lato dorsale di vetro slide up.</li><li> Fare un telaio quadrato di carta Whatman 18X18mm lasciando un 10×10 mm apertura nel mezzo. Carta immergere in acqua fino a saturazione. Luogo intorno alla pupa.</li><li> Usando una siringa da 5 cc riempita con grasso al silicone vuoto, applicare uno strato uniforme di grasso attorno alla cornice Whatman. Lo strato di grasso dovrebbe andare bene all'interno del coprioggetto (Figura 1) e lo spessore dovrebbe essere solo un po 'maggiore del diametro pupa.</li><li> Mettere una piccola goccia d'acqua (1 ml) al centro di un coprioggetto 22×22 millimetri e posizionare il coprioggetti sulla preparazione di sopra in modo che il piccolo contatti goccia d'acqua sulla superficie da immagine, notum in questo caso). Comprimere delicatamente a formare un sigillo completo di grasso vuoto e superficie di contatto piana tra il coprioggetti e cuticola pupa.</li><li> Prep possono poi essere ripreso sul microcopes invertito o verticale, utilizzando epifluorecence, confocale (scansione laser o spinning tipo di disco) oppure a due fotoni confocale. Se fate attenzione, le mosche adulte possono essere recuperati dopo alcuni giorni.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Rappresentante dei risultati:</p><p class="jove_content"> L'utilizzo di un POS specifico per la linea GAL4 (<em> Neuralized</em>-GAL4) attraversato da proteine ​​GFP tag per etichettare il fuso mitotico (tubulina o Tau-GFP) o proteine ​​istoniche (H2B-GFP), si può osservare aereo divisione della divisione cellulare SOP, la lunghezza del ciclo cellulare, o il numero di mitosi divisioni utilizzando lasso di tempo di imaging⁹. Altre proteine ​​di fusione che obiettivo organelli cellulari come Rab GTPasi per segnare diversi comparti endocitico (Rab5-GFP per i primi di endosomi o Rab11 GFP per il riciclaggio endosomi) o proteine ​​importanti nella regolazione del segnale di Notch (Numb-, Partner di Numb-GFP, o Sanpodo -GFP) possono fornire importanti informazioni sui meccanismi della divisione cellulare asimmetrica e il traffico di proteine ​​di membrana^2,3,7,10,11.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figura 1: dissezione pupa e il montaggio. A.</strong> Passo-passo le immagini mostrano la procedura per rimuovere il caso pupa e preparare le pupe intatto per l'imaging cellulare montaggio e dal vivo. Pupe vengono rimossi dal flaconcino e posto, lato dorsale fino, sul nastro doppio bastone attaccato ad una lastra di vetro. Prima colonna, la rimozione del opercolo e strappi lungo il lato del case pupa. Seconda colonna, la rimozione del bozzolo da regione toracica e addominale. La pupa libero è poi sollevato dal caso pupa utilizzando un pennello.<strong> B.</strong> Montaggio pupe tra vetrino e coprioggetto. Pupa è posizionato sul lato dorsale sul vetrino, circondato da una cornice inumidito di carta Whatman. Un cordolo continuo di grasso al silicone estruso vuoto da una siringa funzioni 5cc per sigillare il vetrino coprioggetto-combinazione, proteggendo la pupa di essiccazione e di elevare il coprioggetto in modo che si appoggia delicatamente sul torace pupa. Una piccola goccia di acqua (1 mL) a livello di interfaccia tra il coprioggetti e la cuticola del torace migliora la qualità dell'immagine in modo significativo quando si utilizzano obiettivi ad immersione (acqua o olio).<a href="http://www.jove.com/it/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg/"> Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figura 2: immagini rappresentative delle cellule SOP dal vivo e differenziati gli organi sensoriali esterni scattate con la nostra dissezione pupa e il montaggio procedura. A</strong>. Immagini estratte da una serie storica di una cellula SOP mitotico actina-GFP che esprimono proteine ​​di fusione sotto il controllo di<em> Neuralized-</em> GAL4 (<em> Neur-</em> Gal4/UAS-actin-GFP), nota l'accumulo di actina corticale al solco della scissione (1 immagine / ogni 2 minuti).<strong> B</strong>. Cellule figlie SOP co-esprimono Partner di Numb-RFP (rosso) e Rab5-GFP guidato da<em> Neuralized-</em> GAL4, nota la distribuzione asimmetrica del Pon-RFP in una cellula figlia (pIIb) e la distribuzione dei primi endosomi in entrambe le cellule figlie.<strong> C</strong>. Rendering di volume di una serie Z conto dei differenziati organi sensoriali esterni in una fase tardiva pupa. Strutture cuticola, come mechnosensory setole e peli epidermici sono rivelate dalla cuticola autofluorescenza (rosso). Inoltre, abbiamo utilizzato il sistema MARCM di esprimere Lgl-GFP (guidato da<em> Neuralized-</em> GAL4) in un sottogruppo di cellule sensoriali precursore organo (verde). (Queste immagini sono state tutte acquisite utilizzando una Nikon C1 microscopio confocale utilizzando un obiettivo 60X 1,45 NA)</p>