غزو الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي
Summary
بروتوكول عام لدراسة غزو الخلايا المضيفة من قبل الممرض الجرثومي ، مع التركيز على<em> المكورات العنقودية الذهبية</em> والخلايا البطانية الإنسان.
Abstract
هنا سنقوم بشرح كيف ندرس غزو الخلايا البطانية الإنسان عن طريق البكتيريا العنقودية الذهبية الممرض. ويمكن تطبيق بروتوكول عام لدراسة الغزو خلية بكتيريا أي تقريبا زروع. وسيتم تسليط الضوء على المراحل التي يمكن أن تدرس جوانب محددة من الغزو ، مثل إعادة ترتيب دور الأكتين أو caveolae. تزرع الخلايا المضيفة في قوارير والمصنف عندما جاهزة للاستخدام في 24 لوحات تحتوي كذلك coverslips Thermanox. يسمح باستخدام coverslips اللاحقة إزالة الخلايا من الآبار للحد من التدخل من بروتينات مصل المودعة على الجانبين من الآبار (S. المذهبة التي سوف نعلق). تزرع البكتيريا إلى الكثافة المطلوبة وغسلها لإزالة أي تفرز بروتينات (مثل السموم). يتم نقل Coverslips مع طبقات من الخلايا البطانية متكدسة لوحات 24 بئر جديدة طازجة تحتوي على مستنبت قبل إضافة البكتيريا. ثم يتم تحضين الجراثيم والخلايا معا من أجل المبلغ المطلوب من الوقت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. لS. المكورات هذا هو عادة بين 15-90 دقيقة. تتم إزالة coverslips Thermanox من كل بئر وتراجع غسلها في برنامج تلفزيوني لإزالة البكتيريا غير مرتبط. إذا كان مجموع البكتيريا المقترنة (ملتصقة والمنضوية) هي أن يكون كميا ، ثم توضع في بئر coverslips الطازجة التي تحتوي على تريتون 0.5 ٪ X – 100 في برنامج تلفزيوني. pipetting طيف يؤدي إلى تحلل الخلايا وإكمال يتم تعداد البكتيريا عن طريق التخفيف المتسلسل والطلاء على أجار. اذا كانت هناك حاجة لعدد من البكتيريا التي قد غزت الخلايا ، تضاف إلى coverslips الآبار تحتوي على 500 زراعة الأنسجة ميكرولتر المتوسطة تستكمل مع الجنتاميسين وحضانة استمرت لمدة 1 ساعة ، والتي سوف تقتل كل البكتيريا الخارجية. lysed الخلايا يمكن أن تكون ثم Coverslips غسلها ، والبكتيريا التي تم تعدادها على الطلاء أغار على النحو المبين أعلاه. إذا كانت التجربة يتطلب رؤية مباشرة ، يمكن ان تكون ثابتة وcoverslips ملطخة المجهري للضوء ، أو مضان مبائر أو معدة للفحص المجهري الإلكترون.
Protocol
Discussion
يستند مقايسة وصفنا على مقايسة حماية الجنتاميسين ، والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة غزو الخلايا المضيفة البكتيريا. واستخدمت ملاحظات لعدم قدرة المضادات الحيوية وغيرها من الجنتاميسين لقتل البكتيريا داخل الخلايا في الدراسات المبكرة على غزو الخلايا المضيفة 4-8 البكتيريا. استخدام 48 أو 24 أو حتى 96 – جيدا يسمح لوحات توليد كميات كبيرة من البيانات ، وكمية استنساخه في فترة قصيرة من الوقت وبتكلفة منخفضة نسبيا. في مقايسة غير جذابة أيضا لأنها لا تتطلب معدات متخصصة ، يمكن أن تكون مصممة للعمل مع مختلف الجراثيم والخلايا ، ويمكن استخدامها لدراسة دور كل من عمليات الخلية البكتيرية والمضيفة في غزو 9. في الواقع ، منذ وقت التجارب ، وقد تم فحص الحماية المستخدمة على نطاق واسع الجنتاميسين لقياس الخلية المضيفة غزو من قبل مجموعة من البكتيريا أو تركيبات مختلفة من البكتيريا حتى 10،11. في حين أن المبادئ الأساسية هي أن العديد اختلافات دقيقة في نفس الأسلوب قد تم الإبلاغ عنها. في هذه المقالة قد وصفنا نسختنا وأشار إلى التعديلات التي قد تكون ضرورية لغيرها من البكتيريا أو الخلايا المضيفة. عند تصميم تجربة لقياس المضيف غزو الخلايا باستخدام هذا النهج أن هناك عددا من النقاط الهامة في الاعتبار :
الحساسية البكتيرية للجنتاميسين. قد يبدو هذا واضحا ، ولكن من المهم التأكد من أن هذه البكتيريا التي يجرى بحثها هي عرضة للجنتاميسين في درجة الحرارة ، وتركيز وعلى مدى الفترة الزمنية التي يتعين استخدامها. في حالة عدم الاكتراث ، فإنه قد يكون من الممكن استخدام المضادات الحيوية الأخرى 5. ويمكن اتباع نهج بديل يتمثل في استخدام الإنزيمات lytic (lysostaphin ، mutanolysin ، الليزوزيم) 12.
حضانة وقيحة. عند تنفيذ هذا الاختبار للمرة الأولى ، من المهم لإنشاء حضانة مرات الأمثل واللقاح الجرثومي لاستخدامه. ولذلك ، ينبغي النظر في التجارب الأولية على حد سواء التصاق والغزو على مر الزمن (5 دقائق ليصل الى 6 ساعات). من المهم أيضا لتقييم مدى تأثر غزو من جانب تعدد العدوى (وزارة الداخلية ، وعدد من البكتيريا في الخلية). عموما فإنه من الأفضل استخدام عدد من البكتيريا بأقل عدد ممكن لأن هذا سيؤدي إلى تقليل الأضرار إلى الخلايا المستزرعة. قد يكون غاب عن اختلافات مهمة بين سلالات إذا فترات حضانة طويلة أو قائح كبيرة تستخدم 9،13.
تلف الخلايا ، ومن المهم أن يغسل البكتيريا قبل الاستخدام. ومع ذلك ، لا يقتصر الضرر الخلوي لإنتاج السم. الغزو الجرثومي ، ويمكن استحثاث موت الخلايا المبرمج ، وتعطل الوظائف الخلوية العادية تتسبب جميع الأضرار الخلوية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغلغل الجنتاميسين في الخلية ، وقتل البكتيريا المنضوية إعطاء الانطباع بأن الغزو لم يحدث 14.
شروط الحضانة. ويمكن لدرجة الحرارة وتكوين ثقافة المتوسطة يكون لها تأثير كبير على الغزو. على سبيل المثال ، والغزو من الخلايا العقدية المقيحة هيلا التي تعتمد على وجود فبرونيكتين القابلة للذوبان ، والتي هي عادة موجودة في المصل 15. وهناك اعتبار آخر هو نمو البكتيريا في مستنبت أثناء التجربة.
ثقافة وتقدير من البكتيريا داخل الخلايا. وعلى الرغم TX – 100 قد لا تقتل البكتيريا داخل الخلايا ، فإنه قد تحول دون نموها. على هذا النحو ، فمن المهم للتحقق من النسخ المتماثل على وسائط جرثومية الصلبة في وجود المنظفات. حيث تتأثر ، قد يكون من الممكن استخدام تركيزات أقل من المنظفات أو استخدام بديل مثل سابونين. وهناك فائدة للمقايسة حماية الجنتاميسين على تلطيخ البنفسجي الكريستال والفحص المجهري هو أنه أقل من العمالة المكثفة ، وأنها تسمح للكشف والتمييز بين المجموعات الفرعية من السكان من البكتيريا المنضوية. على سبيل المثال ، S. يمكن أن تنتج إما المذهبة نوع مستعمرة العادي (NCT) أو المتغير مستعمرة صغيرة (SCV) 16 ، والتي لن تكون مميزة من خلال الفحص المجهري للخلايا بكتيرية الفردية. وهناك فائدة من تلطيخ البنفسجي الكريستال والفحص المجهري على مقايسة حماية الجنتاميسين هو يمكن شكلت خلية للتكتل وأن البكتيريا التي تدخل الخلايا "قابلة للحياة ولكن غير زروع" وسيتم الكشف عن 17 حالة.
دراسة دور عمليات الخلية المضيفة في الغزو الجرثومي. استخدمت العديد من الدراسات مثبطات وظيفة الخلايا المضيفة مثل D مثبط حركة الخلايا ، والتي تتعارض مع إعادة ترتيب أكتين. مثل هذه الدراسات يمكن أن تشمل أيضا الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات سطح الخلية وضربة قاضية للجينات محددة سيرنا 18. من المهم جدا للتأكد من أن هذه العلاجات لا تؤثر على صلاحية أو مرفق من الخلايا المستنبتة أو تكون لها آثار سامة على البكتيريا.
التوجهات المستقبلية :
ontent "> لأنه يتم عادة إجراء هذا الاختبار في لوحات متعددة جيدا ثقافة الخلية ، فمن الممكن نظريا لتكييفه مع عملية الفرز الفائق الإنتاجية ، والتي قد تنطوي على دراسة المكتبات وظيفة الخلية مثبطات المحتملة ، ومكافحة العدوى أو المضادات الحيوية صممت لاستهداف البكتيريا داخل الخلايا. كبديل ، يمكن أن تستخدم مثل هذا النهج إلى الشاشة متحولة المكتبات لتحديد الجينات المسؤولة عن الالتصاق ، والغزو ، أو البقاء داخل الخلايا ، وفي بعض الحالات قد يكون من المرغوب فيه لتشمل قوى القص (التدفق) في النظام النموذجي ، على سبيل المثال عندما النمذجة البطانة ، على نحو أوثق محاكاة البيئة في الجسم الحي. التقدم الحالي في مجال تصميم وتصنيع الخلايا التدفق ونظم ميكروفلويديك خلية ثقافة توفر إمكانية توظيف مقايسة الجنتاميسين في حماية المضيف الممرض النماذج التي تضم قوى القص.باختصار ، يقوم بروتوكول الموصوفة هنا على النهج المماثلة المستخدمة على مدى سنوات عديدة. فمن على نطاق واسع ينطبق على العديد من أنواع الخلايا المستزرعة ، والأنواع البكتيرية ويمكن أن تولد كميات كبيرة من البيانات بسرعة وبتكلفة قليلة نسبيا.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (WT 0795880).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | ||
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | ||
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | ||
| HUVECs | Lonza | CC-2519 | ||
| Endothelial basal medium | Lonza | CC-3121 | ||
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza | CC-4092 | ||
| Human endothelial growth factor | Lonza | CC-4017C | ||
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4035C | ||
| GA-1000 | Lonza | CC-4092C | ||
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | ||
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | ||
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher | TKT-210-330P | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886 | ||
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | ||
| T75 flasks | Thermo Fisher | 430641 | ||
| Cytochalasin D | Sigma | C2618 | ||
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | 332615 |
Riferimenti
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. v. o. n. Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
