简单的技术是使用常规的细胞培养基质的动态遮罩投影光刻数字微镜器件的微型神经文化系统的快速生产。这些文化系统可能更天然生物结构的代表,和描述的技术可以适应各种应用。
越来越多,图案的细胞培养环境,成为相关技术研究细胞的特点,和许多研究人员相信在3D 环境代表在体外实验中, 更好地模仿在1-3体内素质的需要。在诸如癌症研究4,5神经工程,心脏的生理6,和细胞基质的相互作用7,8等领域的研究表明,细胞的行为不同于传统的单层培养和三维结构之间的大幅。
水凝胶作为3D环境,因为他们的品种,多功能性和能力,量身定制,通过官能分子组成9-12。创建作为支持细胞矩阵结构,其中包括13静电,弹性体邮票14中存在大量的技术,喷墨印刷,添加剂photopatterning 16,静态的光掩模投影光刻17,动态遮罩microstereolithography 18 15。不幸的是,这些方法涉及到多个生产步骤和/或设备不容易适应传统的细胞和组织培养方法。在本议定书中所采用的技术调整后两种方法,使用数字微镜器件(DMD)创建动态交联几何特定的聚乙二醇(PEG)的水凝胶,通过紫外线发起自由基聚合诱导的光掩膜。由此产生的“2.5D”的结构提供了一个3D环境中,神经生长的制约。我们采用双水凝胶的方法,其中PEG作为一个细胞限制性地区供应结构,否则不成形,但宽容的细胞自组装Puramatrix或琼脂糖凝胶的。这个过程是一个快速简单的一个步骤制造,这是高度重现性好,与传统的细胞培养方法和基板的使用很容易地适应。
整个组织植如胚胎背根神经节(DRG),可以被纳入突起生长的实验检测,如双水凝胶结构。此外,分离的细胞可以被封装在photocrosslinkable或自我聚合凝胶,或选择性地坚持以渗透的支持膜细胞限制性photopatterning。使用的DMD,我们建立了水凝胶的结构〜1mm厚,但薄膜(<200微米),PEG的结构是由氧自由基聚合反应的淬火有限。随后,我们开发出一种技术,利用聚合液,使薄的聚乙二醇结构聚合层以上的石油。
在这个协议中,我们描述了微的神经细胞和组织培养生产的三维凝胶系统迅速建立。双水凝胶结构表明,此处代表在体外模型,可能被证明在神经细胞的存活,迁移,和/或突起的生长和指导的研究涉及非常有用的多才多艺。此外,作为协议可以用于许多类型的水凝胶和细胞的潜在应用是千姿百态,具有广阔的。
本文所述的方法可用于任何寻求简单,重复性的细胞培养系统的调查。从理论上说,由于多种可用photopolymerizable凝胶,环境可定制允许使用任何类型的细胞,包括整个组织植。此外,双水凝胶系统可以改善的空间控制在介绍自我聚合水凝胶,往往会形成对自己的无定形的形状。由此产生的“2.5D”micropatterned水凝胶的结构提供了一个2D的配置,使便捷的微观评价中的神经生长的3D矩阵。的基板上的凝胶聚合,也可以是多种多样的,允许更大的控制实验设计。我们的方法是优化利用细胞培养透水支持,正如我们所看到玻片上(数据未显示)的聚合相比,提高生存能力(图4)。然而,其他聚合表面可能更适用不同的应用:在微流体实验或细胞的总单位,例如,使用在玻璃上制作幻灯片。
我们这些文化系统的经验,确定潜在的困难地区。首先,细心的技术要求,以保持构造的不育。由于笨重的DMD设置性质,它是难以操作的无菌条件下聚合的步骤。为了解决这个问题,描述的方法冲洗步骤是有益的,应在所有媒体使用抗生素。此外,最终聚合结构的厚度和形状是高度依赖的预聚物的混合物的流体行为,和半月板的存在可以导致凝胶结构,太薄或不完全聚合(图6)。可以采取两个步骤来减少形成的半月板内细胞培养插入。对于厚的水凝胶(> 200微米),周围的内壁插入雨- X的简单的涂层是足够的。然而,简要介绍了上述结构(<200微米)薄,油层是需要尽量减少半月板和否定氧自由基聚合淬火。决议被发现,厚度而定,在实现降低特征尺寸越来越较厚的凝胶,。该决议也各不相同,取决于功能是否代表在水凝胶的积极或消极的救济。但是,我们取得了足够高的分辨率与最小特征尺寸的构造上〜100只用显微镜目标聚焦光学微米的规模。
我们的实验表明,这里描述的双水凝胶结构的代表形成突起的生长和指导的基本体外模型奠定了良好的基础。缩微技术是一种适应18,19现有的方法,但我们设置强调一个简单的实现设计和生产细胞培养插入双水凝胶结构优化,提高细胞活力,以及重要的细胞培养插入以前壁组织外植体周围的交联。结果的范围是有限的,我们实验室的利益,但是,我们相信,在本出版物中描述的方法寻找一个相对便宜,快捷,易于使用的三维细胞培养制造方法的研究人员将证明是有益的的模型。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢实验室的教授安东尼Windebank DRG的清扫和文化分享他们的专业知识,以及Shaochen陈教授关于DMD的设置有益的讨论。这项研究是杜兰大学和路易斯安那州摄政委员会(补助部分资金由LEQSF [2009-10] – RD – A – 18)和美国国立卫生研究院(NS065374)。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Digital Micromirror Device | Texas Instruments | DLPD4X00KIT | ||
Collagen Coated Transwell Permeable Support | Corning | 3491 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
Polyester Transwell Permable Support | Corning | 3412 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | ||
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-036 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-164 | ||
Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | ||
Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
DPBS | Invitrogen | 14190-250 | ||
Puramatrix | BD Biosciences | 354250 | ||
PEG 1000 | Polysciences, Inc. | 15178 | ||
Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | 0298913AB | ||
Oil | Have used both canola oil and silicon oil | Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation | ||
OmniCure Series 1000 | Exfo | |||
Rain-X |