Исследование конформационной динамики мембранных белков На месте С Сайт-направленный флуоресцентная маркировка

1. Экспрессии белка Клон мембраны белок в вектор подходит для Xenopus laevis ооциты выражения, такие как pTLN 11 или pSG01MX 12. Оптимизированная векторы содержат как 5 'и 3' Xenopus laevis β-глобина непереведенные регионов 11,12, уникальный сайт рестрикции, и сайт РНК промоутер находится перед 5 'UTR 11. Эти компоненты необходимы для оптимального выражения в ооциты, линеаризации плазмиды до синтеза мРНК и мРНК синтез, соответственно. 2. Цистеин Мутация Кайт-Дулитл участок используется для идентификации трансмембранных доменов целевого белка использованием аминокислотной последовательности белка (ProtScale, ExPASy) 13. Данные отображаются в виде гидрофобности по сравнению с порядковым номером. Остатки, которые отображают положительные значения, скорее всего, найти в трансмембранного домена. Используйте этот участок, чтобы определить наиболее вероятные остатки расположены на границе между трансмембранным и внеклеточных доменов, которые будут мутировал в цистеин. Как определении интерфейса трансмембранный домен и внеклеточной регионе не могут быть предсказаны с полной уверенностью использованием Кайт-Дулитл участок, важно изучить спектр остатка, которые согласно прогнозам, будет на границе раздела. Этот регион белка выбран для предсказал движение fluorophore.During конформационные изменения, флуорофор будет двигаться между гидрофильных и гидрофобных окружающей среды или между более тушение водой и менее водной среды закалки. Каждый из этих прогнозируемых изменений в окружающей среде приведет к изменению интенсивности флуоресценции. QuickChange сайт-направленного мутагенеза Kit (Stratagene) используется для генерации одного внеклеточно доступны конструкций цистеина. Короче говоря, смешайте 5 мкл 10х буфера реакции, 2 мкл 5 нг / мкл ДНК плазмиды, 1,25 мкл каждого из 100 нг / мкл прямого и обратного праймера, 1 мкл дНТФ (100 мм), и 39,5 мкл бидистиллированной водой. Наконец, добавить 1 мкл PfuTurbo ДНК-полимеразы (Stratagene). Праймеры, используемые для этого шага должны быть разработаны с цистеином мутацией в внеклеточных вычета процентов. Программа термоциклер на следующие технические характеристики: 1 цикл при 95 ° С в течение 30 секунд, 12-18 циклов при 95 ° С в течение 30 секунд, 55 ° С в течение 1 минуты и 68 ° С в течение 1 минуты в кб плазмиды длины. Температуры отжига (55 ° С) рассчитывается непосредственно с температурой плавления каждого праймера. Последним шагом может быть запрограммирован на проведение температуры на 4 ° С, если реакция происходит в одночасье. Число циклов зависит от мутации. Используйте 12 циклов для точечных мутаций, 16 циклов для одного аминокислот изменения кислоты, или 18 циклов для различных аминокислот вставками кислоты. Добавить 1 мкл ДПНИ (Новая Англия Биолабс) в реакционную смесь, перемешать с помощью пипетки и центрифуги (6000 оборотов в минуту) в течение 1 минуты. Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° С на водяной бане. Оттепель 10 лучших электро-компетентных клеток (Invitrogen) на льду и инкубировать стерильной SOC СМИ (20 мг / мл триптон, 5 мг / мл дрожжевого экстракта, 1 мг / мл NaCl, 0,4 мг / мл KCl, 0,02 M Mg 2 +, 0,02 М глюкозы, ddH2O) при 37 ° C до необходимости. Алиготе 20 мкл клеток в пробирки на 1,5 мл центрифугу и добавить 1 мкл ДНК переваривается в клетках. Заполните Cell-Porator (Life Technologies) с ледяной водой, установить емкость до 330 мкФ, ставка платежа поститься, и сопротивления на напряжение-Booster до 4 кОм. Внесите 20 мкл клеток / раствора ДНК в клетку-porator кювет. Место в кювет Cell-Porator, закройте крышку, подключите шнур питания и включите диск для правильного кюветы. Установите блок питания для зарядки и удерживайте "вверх", пока напряжение не читает 430. Поверните ручку, чтобы вооружить и нажмите курок. Если есть отрывистый звук, повторите электропорации. Внесите клеток из кювета и передавать их в 1,5 мл SOC СМИ. Инкубируйте в течение 1,5 часа при температуре 37 ° C при встряхивании. Передача 30 мкл SOC / элемент решения LB / ампициллин агаром (10 мг / мл триптон, 5 мг / мл дрожжевого экстракта, 10 мг / мл NaCl, 15 мг / мл агара, DDH 2 O и 100 нг / мкл ампициллин ). Распространение ячеек на пластине и инкубировать пластины при температуре 37 ° С в течение ночи. Урожай одной колонии из пластин и привить 5 мл культур, содержащих LB / ампициллин (10 мг / мл триптон, 5 мг / мл дрожжевого экстракта, 10 мг / мл NaCl, 100 нг / мкл ампициллин DDH 2 O) средства массовой информации. Встряска при 37 ° С в течение 16-20 часов. Выполните ДНК miniprep использованием Nucleospin плазмиды комплект (Macherey-Nagel). Качественно изучить продукт помощью электрофореза в агарозном геле. Quantitiate выход ДНК с использованием Nanodrop 2000c Спектрофотометр (Thermo Scientific). Проверка вставки мутации путем секвенирования ДНК. <p class="Jove_title"> 3. Синтез мРНК Для линеаризации ДНК, дайджест 3 мкг плазмидной ДНК в 50 реакционном объеме L с 5 мкл соответствующего буфера и 1 мкл рестриктазы течение 1 часа при 37,0 ° С. Использование высокого чистого продукта ПЦР Очистка Kit (Roche Applied Science), добавить 350 мкл буфера для связывания во флакон переварить и вихревые кратко. Этот комплект используется, поскольку она содержит guanidiniumisothiocyanate что делает продукт класса РНК. Место спина столбцов в коллекции трубок и нагрузки колонке с раствором ДНК переваривается. Центрифуга при 18000 г в течение 20 секунд и отбросить проточные. Добавить 500 мкл промывочного буфера в колонку. Центрифуга 20 секунд при 18000 г и отказаться проходить через. Добавить 200 мкл промывочного буфера в колонку. Центрифуга 30 секунд или пока столбец сухой при 18000 g. Место спин колонки в автоклаве 1,5 мл центрифужную пробирку и добавляют 50 мкл DEPC обработанных водой к колонке. Элюировать путем центрифугирования в течение 30 секунд при 18000 g. Концентрат элюируют ДНК примерно 15 мкл в результате чего 0,5 мкг в 3 мкл раствора. Выберите правильный mMessage mMachine Kit (Амбион) в соответствии с последовательностью промоутер сайта в плазмидной ДНК (SP6, Т7). Добавьте 5 мкл 1 NTP капитализации смесь, 3 мкл линеаризованной ДНК из предыдущего шага, 1 мкл буфера транскрипции, и 1 мкл соответствующего РНК-полимеразы. Инкубируйте в течение 1,5-2 часов при температуре 37 ° C. Добавить 12,5 мкл LiCl из комплекта, 15 мкл DEPC воды, смешать кратко (не вихря), центрифуги при 11000 г в течение 10 секунд, и хранить при температуре -20 ° С в течение не менее 30 минут для осаждения. Предварительное охлаждение центрифуги до 4 ° С, а центрифуги в течение 15 минут на полной скорости, после выпадения осадков. После центрифугирования коричневые гранулы должны быть видны в нижней части трубы. Тщательно и полностью удалить надосадочную и добавить 150 мкл 70% РНК этанол охлаждали до -20 ° C. Центрифуга при 4 ° С в течение 5 минут на полной скорости. Удалить супернатант полностью, кратко сухие (1-2 мин) в Эппендорф Vacufuge Плюс, и раствориться в настоящее время белых гранул в 12 мкл DEPC воды. Quantitiate выход мРНК с использованием Nanodrop 2000c Спектрофотометр (Thermo Scientific). 4. Удаление ооцитов Этот протокол был одобрен Институциональные животных WPI по уходу и использованию комитета. До операции, лягушка должна быть постился в течение 12 часов, чтобы предотвратить рвоту во время операции. Сделать решения 0,5-3,0 г MS-222, растворенных в воде. Добавить бикарбонат натрия, пока раствор имеет рН 7,0-8,0. MS-222 используется в качестве анестезии для лягушки во время операции. Важно, чтобы носить нитриловые перчатки в любое время при работе с MS-222 и подготовить решение по химической капот Погрузите лягушка в MS-222 раствора до лягушки потерял восстанавливающее и рефлексов ног крайнем случае. Чтобы проверить, отсутствие реакции, щепотка палец лягушку. Место лягушки на спинной стороне на поглощающей стороны мокрые пеленки площадку. Это позволяет избежать повреждения кожи лягушки. Держите мокрой близко бумажным полотенцем, чтобы лягушки во все времена, как лягушка должна быть влажной всей операции. Если глаза открыты лягушка, важно, чтобы увлажнить их с физиологическим раствором. Если лягушки показывает признаки пробуждения, залить анестезии раствор на лягушку и ждать, пока лягушка перестает отвечать на запросы. Выполните вторую щепотку ног, прежде чем продолжить процедуру. Сделайте небольшой надрез целомической либо слева или справа от средней линии лягушки. Разрезы должны быть сделаны на разных сторон с последующей операции. Принесите яичников к внешности лягушки и удалять яичник. Старайтесь не прикасаться яичников кожи лягушки. Если кровотечение происходит, давление со стерильной Q-Tip, пока кровотечение не остановится. Шовный разрез использованием прервал шов картина с 3.0-4.0 Ethicon Викрил шовного материала (Johnson & Johnson). При наложении швов, использование хирургических инструментов, чтобы связать один узел в то время, не дотрагиваясь до кожи лягушки. Кроме того, важно, чтобы шов целомической и слоев кожи отдельно. Это согласуется с Руководящими принципами NIH для яиц и ооцитов уборки в Xenopus laevis (см.: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). После операции, лягушки не должны подвергаться эксплуатации в течение не менее 2 месяцев. Она также должна быть определена, если лягушки достаточно здоров, чтобы пройти последующих операций. Не более 6 операций могут быть выполнены на каждом лягушка с 6-й хирургии будучи терминала. 5. Defoculation ооцитов и мРНК инъекций Изолированных долей яичника делится с ножницами на мелкие части. Сгустки переходят в раствор Рингера + Ca 2 + с коллагеназы (8,6г / л NaCl, 0,3 г / л KCl, и 0,33 г / л CaCl 2). Осторожно встряхните решение переваривать в течение 2 часов при 18 ° C. Если большинство ооциты разделены, мыть ооцитов с раствором Рингера – Ca 2 + (8,6 г / л NaCl и 0,3 г / л KCl). Инкубируйте ооцитов в течение десяти минут в растворе Рингера – Ca 2 +. Передача ооциты раствор Рингера + Ca 2 +. Inject ооцитов с 25 нг мРНК, в конечном объеме 50 нл с Nanoject II Auto-Nanoliter инжектор (Drummond), с 3,5 "Драммонд капилляров. Примечание: количество мРНК варьируется в зависимости от целевого белка. После инъекции, инкубировать ооцитов 3-7 дней в растворе Рингера (90 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 5 мМ MOPS, 2 мМ CaCl 2, рН 7,4) и 1 мг / мл гентамицина при 18 ° С в темноте 8. 6. Сайт-специфическая маркировка флуоресценции До измерения, инкубировать ооцитов в течение 45 мин при загрузке буфера (110 мМ NaCl, 2,5 мМ цитрата натрия и 10 мМ MOPS / Tris при рН 7,4) и 45 мин после загрузки буфера (100 мМ NaCl, 1 мМ CaCl 2, 5 мМ BaCl 2, 5 мМ NiCl 2 и 10 мМ MOPS / Tris при рН 7,4) увеличение внутриклеточной концентрации Na + 14. Для измерения флуоресценции, инкубировать в ооциты после загрузки буфера, который содержит 5 мкМ желаемого флуорофора [напр. tetramethylrhodamine-6-малеимида (TMRM) или флуоресцеин-5-малеимида (FM)] в течение 5-10 минут. После флуорофора маркировки, мыть ооцитов исчерпывающе с красителем, свободной после загрузки буфера 3. 7. Электрофизиология Сделать микроэлектродов, потянув боросиликатного капилляров (1B150F-4, инструменты Всемирного Precision) с помощью микропипетки съемник (модель PC-10, Narishige). Заполните электродов с 3 М KCl и тестирования сопротивления. Сопротивление должно быть в пределах 0,5-1,5 МОм 15. Одета флуоресцентного микроскопа (Carl Zeiss, Axio Ревизора флуоресцентный микроскоп) с 535DF50 возбуждения фильтр, 565 EFLP выбросов фильтр, и зеркало 570DRLP дихроичных (Омега оптический) для сканирования цистеина экспериментов. Место ооцитов в RC-10 камера (Warner Instruments) на флуоресценцию столик микроскопа и аккуратно вставьте сфабрикованы электродов в яйцеклетки. Использование Turbo Tec-05X усилителя (НПИ Electronics), удерживая мембранный потенциал на постоянном уровне и измерять поток ионов через мембрану следующее решение обмена или путем изменения мембранного потенциала. Для одновременного измерения флуоресценции, использование 100 Вт лампы накаливания источника для возбуждения флуорофора доноров и PIN-022A фотодиод (Технологии Соединенных Detector) для обнаружения изменений в интенсивности флуоресценции. Оба усилителя и фотодиод сопряжены через DIGIDATA 1440A система сбора данных (Axon Instruments), с использованием компьютера pCLAMP10 программное обеспечение (Axon Instruments) для сбора и записи. Для цистеина сканирования, измерять изменение интенсивности флуоресценции при использовании стационарного тока напряжением шаги, которые находятся под контролем pCLAMP 10 программное обеспечение (Molecular Devices). В зависимости от мембраны белок, внеклеточной решение предназначено для обеспечения стационарного тока. Корреляция изменений в интенсивности флуоресценции функциональным измерения целевых белков. 8. Анизотропия измерения и определения расстояния ограничений. Анизотропия измерения должны быть проведены вместе с измерения расстояния от 8 до расчета спектра κ 2 значения. Анизотропия меры относительной подвижности флуорофор из-за вращения 16. Использование поляризованного фильтра (Линос Photonics Inc), измерять параллельно и перпендикулярно света, излучаемого FM или TMRM при возбуждении поляризованным светом в аминокислотных остатков, представляющих интерес. Измерения проводятся при решении обмена условий 8 и постоянной мембранного потенциала для определения мобильности флуорофоров. Анизотропия задается г = (я | |-I ⊥) / (Я | | + 2I ⊥), где я | | является параллельным излучаемого света, и я ⊥ является перпендикулярной излучаемого света 16. Для расчета ошибки в измерения расстояния, κ 2 макс = 2 / 3 (1 + Ж + Ж й п + 3F й * F РА) и κ 2 мин = 2 / 3 (1 – (F + F-я ра) / 2 ), где F =-е (г д / р о) 0,5 и F т = (г / р о) 0,5, г является анизотропия TMRM, г г является анизотропия FM, а г о имеет фундаментальное значение анизотропии каждого флуорофора 8 . Для измерения расстояния ограничений, используйте холофермента у которого есть два доступных внеклеточной остаточных цистеинаРАО ЕЭС. Как ооцитов будет проходить в постоянном мембранного потенциала и, следовательно, постоянное расстояние во время измерения, то не нужно быть флуоресценции изменения в зависимости от конформационного состояния белка. Инкубируйте ооцитов в пост загрузки буфера, содержащего 1 мкМ FM (акцептор флуорофора) и 4 мкМ TMRM (донор флуорофора) в течение 30 минут на льду в темноте, или только 1 мкМ FM. Это позволяет проводить измерения для holoenzymes помечены и без акцептора флуорофора 8. Одета микроскоп с 475DF40 фильтра возбуждения, 530DF30 выбросов фильтр, и 505DRLP дихроичных зеркал. Мера временная зависимость доноров отбеливание в присутствии и в отсутствие акцептора флуорофора. Во время курса этих измерений, решение поток должен быть непрерывным. В противном случае тепло индуцированной флуоресценции возрастает с течением времени может наблюдаться. Разница в фотодеструкции с и без акцептора флуорофора используется для вычисления расстояния между двумя остатками. Holoenzymes содержащие только донор флуорофор будет испытывать быстрее фотодеструкции темпами, чем holoenzymes с акцептором флуорофора. Holoyenzymes, содержащих как донорные и акцепторные флуорофора покажут медленные темпы фотодеструкции когда в непосредственной близости друг от друга 8. Использование функции CLAMPEX в pClamp10, средние результаты фотодеструкцией доноров для флуорофора минимум четыре записи яйцеклетки. Как только результаты были усреднены, использования экспоненциальной функции (monoexponential, биэкспоненциальной), чтобы получить кривую наилучшего. Кривая наилучшего соответствия может быть использован для определения постоянной времени для фотодеструкцией доноров флуорофора с и без акцептора. Определить эффективность передачи энергии задается уравнением E = Γ 1-DA / Γ D 17, где GDA относится к постоянной времени для донор / акцептор пары флуорофора и Γ D относится к постоянной времени только для доноров флуорофора. Использование Ферстер equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R O 6), расстояние между меченых остатков цистеина может быть определено; Е является эффективность FRET, R-расстояние между донором и акцептором флуорофора и р о в 50% эффективности расстояние для донора и акцептора сопряжения 17. Р О определяется уравнением R о = (9.7×10 3 JΦ D н -4 κ 2) где J является нормированной спектральной перекрытия излучения донора и поглощения акцептора, Φ D является квантовый выход излучения без донора акцептором флуорофора п-показатель преломления, а κ 2 является ориентация фактором для диполь-дипольных взаимодействий 8. 9. Относительное движение белковых субъединиц Используйте двойные конструкции цистеина, которые помечены акцепторных и донорных флуорофоров. Для этих экспериментов, изменение расстояния между двумя остатками цистеина будет измеряться. Поскольку это так, флуоресценции маркировке следующие интенсивности на каждый остаток должен быть независимым от конформационного состояния белка 8. Таким образом, любое изменение в флуоресценции передачи энергии резонанса будет результат изменения расстояния между донором и акцептором флуорофоров. Одета микроскоп с 475AF40 фильтра возбуждения, 595AF60 выбросов фильтр и 505DRLP дихроичных зеркал. Для этих экспериментов доноров возбуждается и флуоресценции акцептора флуорофора измеряется. Используйте подходящий метод (напряжение, лиганд, решение обмена) для активации мембранных белков и одновременно измерять изменения интенсивности флуоресценции. Увеличение интенсивности флуоресценции будет означать, что два флуорофоров и, таким образом два остатка движутся навстречу друг другу. Уменьшение интенсивности флуоресценции будет означать, что два флуорофоров и, таким образом два остатка движемся дальше друг от друга. Наконец, никаких изменений в интенсивности флуоресценции будет означать, что два флуорофоров и, таким образом два остатка находятся на одинаковом расстоянии от изменения конформации белка. 10. Представитель Результаты Маркировка внеклеточной остатков цистеина с конкретными флуорофоров позволяет исследование движения мембранных белков на конформационные изменения. Типичные напряжения зажим флуорометрии следа показано на рисунке 1. Изменение интенсивности флуоресценции (нижний луч), который является движение флуорофор из более гидрофильных более гидрофобной среде или из большего количества воды тушение менее среды тушение водой, результаты конформационные изменения в белке при растворении обмена (верхняя следа). Эта техника может быть расширенийДед, чтобы определить расстояние между двумя ограничениями остатков. Такие экспериментальные результаты представлены на рисунке 2. В присутствии flurophore акцептора (красный), фотообесцвечивания происходит более медленными темпами, чем без акцептора флуорофора (черный). Скорость фотообесцвечивания напрямую связано с расстоянием между двумя флуорофоров в соответствии с уравнением Ферстер 17. Такие результаты могут быть соотнесены с различных конформационных состояний белка и это будет проверено два электрода напряжения зажим эксперименты, проведенные в тандеме. Рисунок 1. Представителю записи ионного транспорта и изменения в интенсивности флуоресценции. Top, измерения тока зажим в присутствии Na + решение для тестирования и K + тест решение в присутствии 10 мкМ и 10 мМ уабаин. Нижняя, изменения в интенсивности цветения измеряется в тандеме с измерения тока Зажим 3,8,19. Рисунок 2. Временная зависимость фотообесцвечивания. Донор фотодеструкции измеряется в отсутствие (черный) и наличие акцептора флуорофора (красный). Каждая кривая среднем на 4 записей яйцеклетки.