Fabricación de un dispositivo de microfluidos para la compartimentación de las neuronas y los axones Soma

Parte 1: Preparar el dispositivo de microfluidos neurona A 3 "oblea de silicio con un patrón de hechos de SU-8 mediante fotolitografía se utiliza para convertir el polidimetilsiloxano (PDMS) molde de microfluidos. Nos referimos a la SU-8 de obleas de silicio estampado como moldes del amo, o" maestros ". PDMS se mezcla con el agente de curado en w / w proporción de 10:1, es decir, por 10 gramos de PDMS, 1 gramo de catalizador se añade a la misma. El PDMS se mezcla bien y se vierte sobre la oblea de silicio. La oblea de silicio se encuentra a unos 10 cm de poliestireno plato de Petri. Se tarda aproximadamente 12 a 15 g de PDMS para cubrir el principal con un espesor de aproximadamente 4 mm. El maestro con el PDMS se coloca en un desecador de vacío con la tapa de la placa de Petri, y el vacío se aplica. Esto se hace para ayudar a eliminar las burbujas de la PDMS que se introdujeron durante la agitación en el del agente de curado. Se tarda aproximadamente 15 minutos para que las burbujas de aire que ser eliminado. El maestro con PDMS se quita de en el desecador. Una pistola de aire con un filtro de 0,45 um se utiliza para eliminar las burbujas restantes. El maestro se coloca sobre una placa de 80 ° C caliente durante 1 hora de curar. Nota: Si un desecador de vacío no está disponible, el maestro puede dejarse a temperatura ambiente durante varias horas. Las burbujas de aire con el tiempo se disipará por sí mismos. Si un plato caliente no está disponible, el PDMS se cura a temperatura ambiente, después de 24 horas. Nota: También es importante asegurarse de que el maestro es el nivel durante el proceso de curado. Parte 2: Cortar el dispositivo de microfluidos neurona Una vez que el PDMS se cura en el maestro, que es llevado a una campana de limpieza. Usando una hoja de bisturí, un círculo se corta en todo el perímetro de los dispositivos. Cuando uno inserta el disco en el PDMS, es importante ponerse en contacto con la oblea de silicio, pero no poner demasiada presión sobre la lámina, de lo contrario el maestro se agrieta. Con un círculo de cortar todo el camino alrededor de los dispositivos (hay 4 equipos por cada 3 "Maestro de silicio), el PDMS es cuidadosamente levantado del maestro. Este se puede iniciar girando suavemente la hoja de bisturí, ya que se inserta en la corte antes de . A continuación, los embalses están perforados en el dispositivo mediante un 8 mm de tejido biopsia en sacabocados. Los dispositivos están en cuartos y luego el exceso de PDMS recorta de modo que el dispositivo se encaja perfectamente en la cubierta del cristal de Corning (N º 1) 24 mm x 40 mm. El nitrógeno se utiliza aire para soplar los residuos restantes. Restos obstinada también se pueden eliminar con la marca 3M Scotch 471 cinta de vinilo. Parte 3: Plasma unión de los dispositivos de cubreobjetos de vidrio. Limpiador de plasma se utiliza para unir una Harrick los dispositivos de neurona a la cubierta se desliza. En pocas palabras, los productos se colocan en el filtro de plasma y una bomba de vacío se utiliza para evacuar el aire de la cámara. Después de la presión de vacío ha alcanzado los 300 miliTorr, se activa la alimentación de la bobina eléctrica y establece en alto. La bobina eléctrica crea plasma, "un gas parcialmente ionizado compuesto de electrones, iones y átomos neutros o moléculas" – http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , de las moléculas de aire que queda a la izquierda en la cámara. El plasma genera especies reactivas en la superficie del vidrio y el dispositivo, que cuando se colocan juntos formarán una unión permanente. El plasma también convierte las superficies hidrófilas, que ayuda a facilitar la incorporación de líquidos. Además, el filtro de plasma esteriliza los dispositivos. La superficie del dispositivo de PDMS que contiene el dispositivo de microfluidos se coloca boca arriba en el filtro de plasma junto con las diapositivas de cristal. Las superficies de los tratados con plasma de la copa y el dispositivo de microfluidos son ensambladas en contacto unos con otros en una mesa de trabajo limpia y luego se colocan en placas de 60 mm estériles. Las superficies tratadas formar un vínculo estrecho irreversible. A 10 minutos de plasma de unión de los dispositivos de cristal, poli-L-lisina (PLL) se añade al dispositivo. Después de 10 minutos, la hidrofilia del dispositivo se reducirá por lo que es difícil para el PLL para entrar en el dispositivo. Nota: Es importante para comprobar si las burbujas de aire en el dispositivo después de la adición de PLL. Las burbujas de aire en el canal principal no son deseables, ya que se oxidan las células. Un método fácil para eliminar las burbujas de aire existente es utilizar una pipeta P200 lleno de 150 ul de líquido (en este caso PLL), coloque la punta directamente en la apertura del canal principal, y presione el P200 con fuerza. Esto puede ser necesario repetir varias veces, pero finalmente la fuerza de la pipeta impulsará las burbujas. Los dispositivos que contienen PLL se dejan incubar durante la noche en un estándar de cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Al día siguiente, el devicios se lavan dos veces rápidamente con autoclave dH2O. Durante este proceso, el líquido nunca es totalmente eliminado de los canales principales, sólo a partir de los embalses. La eliminación de líquidos de los principales canales se introducen burbujas. Después de dos lavados rápidos, los dispositivos están llenos de autoclave dH2O y volver a colocar en la incubadora durante un mínimo de 3 horas, o toda la noche. Al día siguiente, los dispositivos son una vez más, lavados 2 veces rápidamente con autoclave dH2O. Entonces, los medios de comunicación neural basal, con los suplementos necesarios B27 y glutamax para el cultivo de neuronas de rata primaria, se añade a los dispositivos. Los dispositivos se colocan de nuevo en la incubadora para su uso futuro. Los dispositivos ya están listos para la siembra de las neuronas.