Fabrication d'un dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones

Partie 1: Préparation de l'appareil neurone microfluidique A 3 "wafer de silicium avec un motif faite de SU-8 par photolithographie est utilisée pour lancer le polydiméthylsiloxane (PDMS) moule microfluidique. Nous nous référons à l'SU-8 plaquette de silicium à motifs comme moules maître, ou« maîtres ». PDMS est mélangé avec l'agent de durcissement à p / p ratio de 10:1, qui est, pour 10 grammes de PDMS, 1 gramme de durcisseur est ajouté. Le PDMS est ensuite bien mélangé et versé sur la plaquette de silicium. La plaquette de silicium est contenu dans un 10 cm de polystyrène boîte de Petri. Il faut environ 12 g à 15 g de PDMS afin de couvrir le maître d'une épaisseur de 4 mm environ. Le maître avec le PDMS est ensuite placé dans un dessiccateur à vide avec le couvercle de la boîte de Petri, et le vide est appliqué. Ceci est fait pour aider à éliminer les bulles d'air du PDMS qui ont été introduites au cours de l'agitation dans de l'agent de durcissement. Il faut environ 15 minutes pour les bulles d'air d'être enlevé. Le maître avec PDMS est retiré de la dessiccateur. Un pistolet à air avec un filtre de 0,45 um est utilisé pour enlever les bulles restantes. Le maître est alors placé sur une plaque de 80 ° C pendant 1 heure chaude de guérir. Remarque: Si un dessicateur sous vide n'est pas disponible, le maître peut être laissé à température ambiante pendant plusieurs heures. Les bulles d'air éventuellement dissiper par leurs propres moyens. Si une plaque chauffante n'est pas disponible, le PDMS se durcir à température ambiante après 24 heures. Remarque: Il est également important de s'assurer que le maître est de niveau pendant le processus de durcissement. Partie 2: Découpage du périphérique neurone microfluidique Une fois que le PDMS est guéri sur le maître, il est pris d'une hotte propre. En utilisant une lame chirurgicale, un cercle est coupé autour du périmètre de ces dispositifs. Quand on insère la lame dans le PDMS, il est important de prendre contact avec la plaquette de silicium, mais de ne pas mettre trop de pression sur la plaquette, sinon le maître va se fissurer. Avec un cercle coupé tout autour des appareils (il ya 4 appareils par chacun 3 "Maître de silicium), le PDMS est soigneusement décollé le maître. Cela peut être démarré en tordant avec précaution la lame chirurgicale car il est inséré dans la coupe avant . Ensuite, les réservoirs sont perforées dans l'appareil en utilisant un 8 mm biopsie punch. Les appareils sont ensuite écartelé et l'excès de PDMS parés de suite afin que le dispositif s'adapte parfaitement sur Corning Couvercle en verre (n ° 1) 24 mm x 40 mm. L'azote de l'air est utilisé pour souffler les débris excès. Les débris tenaces peuvent aussi être retirés à l'aide de 3M Scotch 471 ruban vinyle. Partie 3: Plasma collage des dispositifs à lamelles de verre. Nettoyant plasma est utilisé pour coller une Harrick les appareils neurone à l'lamelles. Brièvement, les appareils sont placés dans le nettoyeur plasma et une pompe à vide est utilisée pour évacuer l'air de la chambre. Après la dépression a atteint 300 milliTorr, est sous tension à la bobine électrique et un réglage élevé. La bobine électrique crée le plasma ", un gaz partiellement ionisé composé d'électrons, des ions et des atomes ou molécules neutres» – http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , sur les molécules d'air restant dans la chambre de gauche. Le plasma crée des espèces réactives à la surface du verre et du dispositif qui, lorsque mis ensemble forment une liaison permanente. Le plasma se transforme aussi les surfaces hydrophiles, ce qui facilite l'ajout de liquides. De plus, le nettoyeur de plasma stérilise les dispositifs. La surface de l'appareil PDMS qui contient le dispositif microfluidique est placée face visible dans le nettoyeur de plasma avec les lames de verre. Les surfaces traitées plasmatique du verre et du dispositif microfluidique sont assemblés en contact les uns avec les autres sur un banc propre, puis placé dans stériles boîtes de 60 mm. Les surfaces traitées former un lien étroit irréversible. Dans les 10 minutes de plasma liant les périphériques au verre, poly-L-Lysine (PLL) est ajouté à l'appareil. Après 10 minutes, l'hydrophilie de l'appareil diminue ce qui rend difficile pour le PLL pour entrer dans le dispositif. Note: Il est important de vérifier les bulles d'air dans l'appareil après l'ajout de la PLL. Les bulles d'air dans le canal principal sont indésirables, comme ils le feraient oxydent les cellules. Une méthode facile pour enlever les bulles d'air existante est d'utiliser une pipette remplie P200 avec 150 ul de liquide (dans ce cas PLL), placez la pointe directement à l'ouverture du canal principal, et appuyer sur le P200 avec force. Ce peut être nécessaire de répéter plusieurs fois, mais finalement la force de la pipette conduira les bulles. Les appareils contenant PLL sont autorisés à incuber pendant la nuit dans une norme incubateur de culture tissulaire à 37 ° C avec 5% de CO 2. Le lendemain, le devices sont rincées deux fois rapidement avec autoclave dH2O. Pendant ce processus, le liquide n'est jamais entièrement retiré des canaux principaux, seulement à partir des réservoirs. En enlevant le liquide des canaux principaux apparition de bulles. Après deux rinçages rapides, les périphériques sont remplis avec autoclave dH2O et replacée dans l'incubateur pour un minimum de 3 heures ou toute la nuit. Le lendemain, les appareils sont à nouveau rincées 2 fois rapidement avec autoclave dH2O. Ensuite, les médias neurones basale, contenant les suppléments nécessaires B27 et glutamax pour les neurones primaires de rat en culture, est ajoutée aux périphériques. Les appareils sont replacés dans l'incubateur pour une utilisation future. Les appareils sont maintenant prêts pour l'ensemencement des neurones.