Всего Запись сотовый от органотипической Подготовка Кусочек Неокортекс
Summary
Это протокол для подготовки и поддержания неокортекса подготовки ломтик в органотипической культуры с целью создания электрических записей из пирамидных нейронов.
Abstract
Мы изучали выражения и функциональные роли напряжения закрытого калиевые каналы в пирамидных нейронов коры головного мозга крысы. Из-за отсутствия конкретных фармакологических средств для этих каналов, мы взяли генетический подход к манипуляциям с каналом выражения. Мы используем органотипической подготовки культура (16) в целях сохранения морфологии клеток и ламинарного структуры коры головного мозга. Как правило, мы изолировать острой неокортекса срезов на послеродовой 8-10 дней и сохранить ломтики в культуре в течение 3-7 дней. Это позволяет нам изучать нейронов на того же возраста тем, кто в нашей работе с острыми кусочками и сводит к минимуму развитие избыточных возбуждающими связями в срез. Мы записываем с визуально-определены пирамидных нейронов в слоях II / III или V с помощью инфракрасной подсветки (ИК-) и дифференциальный интерференционный контраст микроскопии (ДВС-синдром) с целыми зажим патч ячейки в текущем или напряжения зажимом. Мы используем biolistic (Gene пушка) трансфекции дикого типа или мутантного ДНК калиевого канала манипулировать выражением каналов для изучения их функции. Трансфекции клетки легко идентифицировать по epifluorescence микроскопии после совместной трансфекции кДНК зеленый флуоресцентный белок (GFP). Мы сравниваем записи трансфицированных клеток на соседние, untransfected нейронов в одном слое из того же фрагмента.
Protocol
Discussion
Мы изучали выражения и функциональные роли напряжения закрытого калиевые каналы в пирамидных нейронов коры головного мозга крысы (4, 9-11). Из-за отсутствия конкретных фармакологических средств для этих каналов, мы используем генетический подход для управления каналом выражения (1,14,15,17-1…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Маюми Сакураба и Ребекка Foehring за выдающиеся технической помощи. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить д-ра. Родриго Андраде за помощь в реализации органотипической культуры нарезать и biolistic протоколы трансфекции и д-р Жанна Nerbonne за предоставление нам кДНК конструкции для трансфекции. Эта работа была поддержана NIH грант: NS044163 от NINDS (для RCF).
Materials
Surgery / transfection / culture:
- Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
- Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
- Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
- Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
- disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
- 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
- Tefzel Tubing: #165-2441
- Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984- 3766).
Media:
- Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
- HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
- Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
- 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording:
- Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
- Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
- Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
- Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
- IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).
Riferimenti
- Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
- Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
- Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).
- Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons. Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
- Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue. Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).
- Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones. J Physiol. 571, 371-389 (2006).
- Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).
- Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons. J Physiol. 581, 941-960 (2007).
- Johnson, H. A., Buonomano, D. V. A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes. Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).
- Johnson, H. A., Buonomano, D. V. Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices. J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).
- Malin, S. A., Nerbonne, J. M. Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).
- O’Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons. J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).
- Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons. J Neurochem. 75, 882-885 (2000).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- O’Brien, J. A., Lummis, S. C. Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun. Nat Proc. 1, 977-981 (2006).
- Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
- Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. . J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).
