ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

1. Memeli Hücresi Kültürü NU-ELISA kültürde yetişen herhangi bir memeli hücre tipi yapılabilir. Biz, böylece birkaç farklı antikorları (Abs) deneyleri izin nükleozom aynı yüklü birkaç ELISA plakaları hazırlamak için yeterli miktarda izole edilebilir, böylece hücrelerin büyük gruplar orta hazırlamak için tercih ediyor. Aşağıdaki kültürü ölçekleri yeterli malzeme sağlar: Fare embyronic kök hücreler, hücre bir ya da iki adet 15 cm tabak besleyici hücreler olmadan büyür. Fibroblastlar için 5 ila 10 15 cm tabak, izdiham büyür. 2. Çekirdeklerin izolasyonu Not: olarak belirtilen hariç tüm adımları önceden soğutulmuş tamponlar ile buz üzerinde. Hücreleri Trypsinize, plaka başına 3 ml tripsin ile birleşir ve buz gibi soğuk PBS / butirat 20 ml ekleyin. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. 10 ml PBS / butirat hücrelerinin yeniden süspanse edin ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj. Proteaz inhibitörleri (Sigma-Aldrich P-8340) ile 4 ml lizis tamponu yeniden süspanse edin. B tipi havaneli ile buz üzerinde 20 vuruş homojenize Dounce. 4 10 dakika 2000g santrifüjleyin ° C (Süpernatant sitoplazma içerir, bu protokol için gerekli değildir, ancak istenirse, diğer kullanımlar için kaydedilebilir). 2 ml buz yıkama tamponu C pelet (proteaz inhibitörleri ile) tekrar Katman 5 ml% 30 sukroz minder üzerinde yeniden süspanse malzeme, daha sonra 5 dakika sallanan bir kova rotor 2400g santrifüjlenir. Çekirdekler, yastık yoluyla göç, ve enkaz arayüzü kalır. Dikkatle çıkarın ve tüm sıvı hacmi 250 ul buz soğuk yıkama tamponu C + proteaz inhibitörleri çekirdekleri tekrar süspansiyon. 3. Yerinde Micrococcal Nükleazlar (MNase) Sindirim tarafından nükleozom izolasyonu Biz kromatin süpernatantı ücretsiz bozulmamış nükleozom sürücü hipotonik bir tedavi takip MNase ile onları beslerken çekirdeklerin içinde in situ sindirilir bir yordamı kullanın. 3 ul 0.1 M CaCl 2 örnek ekleyin. 37 ° C ısıya blok koyun. 37 ° C sıcaklık varsaymak izin verin. 2 adet MNase (2 units/10μl MNase tampon içinde çözünmüş Micrococcal Nükleazlar, Sigma-Aldrich), daha sonra 37 inkübe ° C 12 dakika, bir pipetlemeyin ucunu kullanarak sık karıştırma. Reaksiyonu durdurmak için 0.5 M Na-EDTA, pH 8.0 ul 6 ekleyin. Buz koyun. Süpernatant atmak için 2000g, 4 dakika santrifüjleyin. 300 ul 0.2 mM Na-EDTA pelletini tekrar. 1 saat buz üzerinde zaman zaman nazik pipeting saklayın. (Bu hipotonik koşulları çekirdekleri ücretsiz nükleozom kurtarmak). 4 dakika süreyle 3000 g santrifüjleyin 4 ° C Buz üzerinde, ücretsiz nükleozom içeren süpernatant kaydedin. 300 ul 0.2 mM Na-EDTA ile tekrar pelletini tekrar. 1 saat buz üzerinde zaman zaman nazik pipeting saklayın. 4 4min için 3000g santrifüjleyin ° C Süpernatantı saklayın ve 5. adımdan itibaren ilk süpernatant ile birleşir. -80 ° C'ye çıkan mononucleosome hazırlıkları aliquoted ve saklanabilir Not: kromatin miktarı kabaca 10 ul örnek 260 nm'de absorbans ölçümü ile quantitated 990 ul su eklenir. A 260 = 10 (1 / 100 dilüsyon için ayarladıktan sonra) kromatin 1mg/ml karşılık gelir. Ayrıca kendi DNA içeriği, ağırlıklı olarak uzunluğu 146 bp DNA içermelidir MNase sindirimler kalite ve ölçüde izlemek için, yukarıdaki prosedürü sırasında, küçük örnekler muhafaza edilmesi ve daha sonra analiz. Laddering eksik MNase sindirim göstergesidir. Not: Şekil 1 nükleer izolasyon ve MNase sindirimler adımları diyagramlanabilmiştir özetini içerir. 4. Nucleosome-ELISA (NU ELISA) Biz 96 ELISA microtiter plakalar üzerinde immobilize edilmiştir yerli bozulmamış nuclesosomes içeren kesirler PTMS algılar. Her bir örnek için, 2 kat dilüsyonlarının bir dizi yapmak ve bu üç nüsha olarak kuyu üzerine kaplanmıştır. 4 ° C 50 ul / kuyu kaplama tampon içinde seyreltilmiş nükleozom. Gecede Coat MaxiSorp plakalar Nükleozom Önerilen seri iki yönlü dilüsyonları sadece alt kaplama tampon (0 mg kromatin), 0.1 mg, 0.05 mg, 0.025 mikrogram, 0.0125 mg, 0.00625 mg, mcg 0,00313 0,00156 mg ekleyerek üst satırdan alt satıra hazırlanan satır. (Not: Bu adım için plakası örtüleri ihtiyaç vardır.) Sabah, bir tabak yıkama ile toplam 10 dakika oda sıcaklığında (RT) 200 ul / iyi PBS/0.5% Tween-20 ile plakalar 4 kez yıkayın. Blok 1 saat RT 100 ul / Tween-20 /% 5% PBS/0.05 BSA. Briskly ters plaka sallayarak engelleme tamponu çıkarınlavabonun üzerinde. Kapak ve -20 ° C'de plakaları mağaza, ya da doğrudan bir sonraki adıma gidin. 1 ° Abs PBS/0.05% rotator 1 saat oda sıcaklığında inkübe Tween-20 /% 5 BSA, 50 / ml iyi seyreltilmiş 1:1000 bir ses (ya da gerektiği gibi) ekleyin. RT 200 ul / iyi PBS/0.5% Tween-20 ve toplam 10 dakika için bir tabak yıkama plakalar 4 kez yıkayın. At turp peroksidaz (HRP) konjuge 2 ° Abs PBS/0.05% rotator bir saat için RT Tween-20 /% 5 BSA (ya da gerektiği gibi) 1:5000 sulandırılmış ekleyin. 200 ul / PBS/0.5% Tween-20 ile plakalar 4 kez yıkayın. Her yıkama bir tabak yıkayıcı RT ve 10 dakika olmak üzere toplam. RT 10 dakika için her bir kuyunun 50 ul TMB substrat ekleyerek plakalar geliştirin. 50 ul / kuyu 4 SO H 2 2N, ekleyerek reaksiyon durdurun ve plakaları 450 nm okuyun. (İpucu: absorbans okuma önce kuyularda herhangi bir hava kabarcığı dağıtmak için bir tabak rotor kullanarak 2 dakika süreyle 1500 rpm'de Santrifüj). Nicel ve istatistiksel analizler için tablo dosyaları okuma ihracat. Reaktifler PBS / butirat 135 mM NaCl 2.5 mM KCl 8 mM Na 2 HPO 4 1.5 mM KH 2 PO 4 10 mM Na-butirat Lizis Tampon 250 mM sakkaroz 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 10 mM Na-butirat 4 mM MgCl 2 % 0.1 Triton X-100 C yıkama tamponu 250 mM sakkaroz 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 10 mM Na-butirat 4 mM MgCl 2 Sakkaroz Yastık % 30 (w / v) yıkama tamponu C sakaroz Microccocal Nükleazlar Tampon 5 mM Napo 4 Tampon, pH 7.0 0.025 mM CaCl 2 Kaplama tampon Çözüm A + 80ml 170ml Çözüm B + 250ml dH 2 O Çözüm: 0.2 M Na 2 CO 3 Çözelti B: 0.2 M NaHCO 3 5. Temsilcisi Sonuçlar NU-ELISA yöntemi, kromatin mononucleosomes şeklinde hazırlanmış olan yüklenebilir hazırlanan birkaç aynı plakaları bir dizi kullanma. Biz genellikle, her biri farklı anti-PTM özel antikorlar (Abs) probed böylece aynı yüklü levhalar bir dizi hazırlıyoruz. Biz de her zaman değişiklik devlet toplam kromatin yükleme kontrolü dikkate alınmaksızın histon algılar Ab probed bir tabak hazırlayın. Bu kontrol, daha sonra kantitatif farklı örneklerinden hazırlanan nükleozom PTM içerik karşılaştırmak için şarttır. , Biz bu yaklaşımı kullanarak ham absorbans değerleri düzeltmenize, belirli bir kromatin örneklem içinde PTMS düzeylerini ölçmek için: Öncelikle, biz hiçbir kromatin (arka plan genellikle ihmal edilebilir) içeren kontrol kuyulardan elde edilen değerler kullanılarak herhangi bir arka plan sinyali çıkarın. Daha sonra Ab değişiklik devletin bağımsız nükleozom algılar bir test aynı yüklü plaka elde NU-ELISA sonuçlarına PTM özel sinyaller standartlaştırmak. (Bunun için histon H2A veya H2B için spesifik poliklonal Abs kullandık). Daha sonra, kromatin her seyreltme ve sapmaların belirlemek ve ELISA testinin doğrusal kısmını elde edilen verileri kullanabilir. NU-ELISA matematiksel ve istatistiksel analizler ayrıntılı örnekler, daha önce 4 bildirilmiştir Şekil 1. NU-ELISA adımları şematik diagam. A. Memeli Hücreleri hasat; B. Çekirdekler Dounce saat hücreleri ayrılıromogenization, C. hücreler santrifüj sonra% 30 w / v sakaroz yastık, D. üst yüklenen bozulur, çekirdeklerin pelet yatırılır, E, F. Kromatin MNase tarafından ağırlıklı olarak mononucleomes in situ sindirilir, G, H ben Çözünür mononucleosomes hipotonik tedavi ve artık nükleer malzeme tekrarlanan santrifüj tarafından ayıklanır. J. Mononucleosomes farklı örnekleri (etiketli samp Bu durumda 1 ve 2) aynı yüklü levhalar seri mikrotiter kuyuları kaplı ve sorgulandı. toplam kromatin yükleme belirlemek için PTM özel Abs ve PTM bağımsız Abs. K. diferansiyel sinyal algılama düzeyleri, onların PTM içeriği farklı iki örnek tasviri, henüz anti-H2B immünoreaktivite tarafından değerlendirilecek benzer genel kromatin içeriğe sahip .