Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

1. Cultura de células de mamíferos NU-ELISA pode ser realizado em qualquer tipo de células de mamíferos que podem ser cultivadas em cultura. Nós preferimos preparar moderada a grandes lotes de células para que nucleossomos podem ser isoladas em quantidade suficiente para preparar vários pratos idênticos carregados ELISA, permitindo assim que os testes com vários anticorpos diferentes (Abs). As escalas cultura a seguir fornecem amplo material: De células-tronco do mouse embyronic, crescer um ou dois pratos de 15 cm de células sem células alimentadoras. Para fibroblastos, crescer 5-10 cm para 15 placas de confluência. 2. Isolamento de Núcleos Nota: Todos os passos estão no gelo com pré-refrigerados buffers, excepto quando indicado. Trypsinize células com 3 ml de tripsina por placa, combinar e adicionar 20 ml de PBS gelado / butirato. Centrifugar a 1000 rpm por 5 min. Ressuspender as células em 10 ml PBS / butirato e centrifugar a 1000 rpm por 5 min. Ressuspender em 4 ml tampão de lise com inibidores da protease (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogeneizar 20 cursos com pilão tipo B no gelo. Centrifugar a 2000g por 10 min a 4 ° C. (O sobrenadante contém citoplasma, o que não é necessário para este protocolo, mas pode ser economizada para outros usos, se desejar). Ressuspender o sedimento em 2 ml de gelo frio tampão de lavagem C (com inibidores da protease). Camada do material ressuspenso mais de 5 ml almofada sacarose 30%, então centrifugue a 2400g por 5 min em um rotor de caçamba móvel. Núcleos migram através almofada, e os restos permanece na interface. Retire todo o volume de líquido com cuidado e ressuspender os núcleos em 250 mL de tampão de lavagem gelada C + inibidores da protease. 3. Isolamento de Nucleossomos por in situ Micrococcal Nuclease Digestão (MNase) Usamos um procedimento em que a cromatina é digerida in situ dentro de núcleos, infundindo-lhes MNase, seguido por um tratamento hipotônico para livre no disco nucleossomos intactos no sobrenadante. Adicionar 3 mL 0,1 M CaCl 2 para a amostra. Coloque em 37 ° C em bloco de calor. Permitem assumir 37 ° C de temperatura. Adicione 2 unidades MNase (Micrococcal Nuclease, Sigma-Aldrich, dissolvido em 2 units/10μl em tampão MNase), então incubar a 37 ° C por 12 min, com mistura freqüentes usando a ponta da pipeta. Adicionar 6 mL de 0,5 M pH Na-EDTA, 8,0 para parar a reação. Coloque sobre o gelo. Centrifugar a 2000g por 4 min, elimine o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 300 mL 0,2 mM Na-EDTA. Loja em gelo por 1 h com pipetagem suave ocasionais. (Estas condições hipotônica libertar nucleossomos livre de núcleos). Centrifugar a 3000 g por 4 min a 4 ° C. Salve o sobrenadante, que contém nucleossomos livre, no gelo. Ressuspender o sedimento novamente com 300 mM 0,2 mL de Na-EDTA. Loja em gelo por 1 h com pipetagem suave ocasionais. Centrifugar a 3000g por 4min a 4 ° C. Manter o sobrenadante e combinar com o primeiro sobrenadante da etapa 5. Os preparativos resultando mononucleosome pode ser aliquotado e estocado a -80 ° C. Nota: A quantidade de cromatina pode ser grosseiramente quantificada pela medição da absorvência a 260 nm de uma amostra de 10 ml adicionadas a 990 mL de água. A 260 = 10 (após o ajuste para a diluição 1 / 100) corresponde a cerca de 1mg/ml de cromatina. Além disso, durante o procedimento acima, pequenas amostras podem ser retidos e posteriormente analisadas por seu conteúdo de DNA para monitorar a qualidade ea extensão da digestão MNase, que deve conter predominantemente DNA de 146 bp de comprimento. Laddering é indicativo de digestão MNase incompleta. Nota: Fig.1 contém um resumo diagramado de isolamento nuclear e as etapas de digestão MNase. 4. Nucleossomo-ELISA (NU-ELISA) Detectamos PTMs em frações contendo nativa intacta nuclesosomes que foram imobilizados em 96 placas de ELISA bem microtitulação. Para cada amostra, fazemos uma série de duas diluições, e estes são revestidos em poços em triplicado. Revestir as placas Maxisorp overnight a 4 ° C com 50 ul / poço de nucleossomos diluída em tampão de revestimento. Sugeriu diluições de série do nucleossomos são preparados a partir de linha superior a linha de fundo pela adição de 0,1 mg, 0,05 mg, 0,025 mg, 0,0125 g, 0,00625 mg, 0,00313 mg, 0,00156 mg, com tampão de revestimento apenas (0 cromatina mg) no fundo linha. (Nota: cobre placa são necessários para esta etapa.) De manhã, lave os pratos 4 vezes com 200 mL / poço PBS/0.5% Tween-20 em temperatura ambiente (RT) para um total combinado de 10 min com uma máquina de lavar prato. Bloco 1 hora em temperatura ambiente com 100 ul / poço PBS/0.05% BSA Tween-20% / 5. Remova o tampão de bloqueio, agitando a placa invertida rapidamentesobre uma pia. Cubra e guarde as placas a -20 ° C, ou ir diretamente para a próxima etapa. Adicionar 1 ° Abs em um volume de 50 l / bem diluído 1:1000 (ou conforme necessário) em PBS/0.05% Tween-20% / 5 BSA, incubar a RT por 1 hora em um rotador. Lavar as placas 4 vezes com 200 mL / poço PBS/0.5% Tween-20 em RT e para um total combinado de 10 min em uma máquina de lavar prato. Adicionar peroxidase de rábano (HRP) conjugado com 2 ° Abs, diluído 1:5000 (ou quando necessário) em PBS/0.05% Tween-20% / 5 BSA em temperatura ambiente por uma hora em um rotador. Lavar as placas 4 vezes com 200 mL / poço PBS/0.5% Tween-20. Cada lavagem é de RT e para um total de 10 minutos com uma máquina de lavar prato. Desenvolver as placas, adicionando 50 ul de substrato TMB em cada poço por 10 min em temperatura ambiente. Pare a reação adicionando 50 ul / poço de 2N H 2 SO 4 e ler as placas de 450 nm. (Dica: Centrifugar a 1500 rpm por 2 min usando uma placa de rotor para dissipar as bolhas de ar nos poços antes absorbâncias leitura). Export as leituras de arquivos de planilhas para análises quantitativas e estatísticas. Reagentes PBS / butirato 135 mM NaCl 2,5 mM KCl 8 mM Na 2 HPO 4 1,5 mM KH 2 PO 4 10 mM Na-butirato Tampão de Lise 250 mM de sacarose 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 10 mM Na-butirato 4 mM MgCl 2 0,1% Triton X-100 Tampão de lavagem C 250 mM de sacarose 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 10 mM Na-butirato 4 mM MgCl 2 Almofada sacarose 30% (w / v) sacarose em tampão de lavagem C Microccocal Nuclease buffer 5 mM NaPO 4 tampão, pH 7,0 0,025 mM CaCl 2 Buffer de revestimento Solução 80ml A + B + Solução 170ml 250ml dH 2 O A solução: 0,2 M Na 2 CO 3 Solução B: 0,2 M NaHCO 3 5. Resultados representante Utilizando o método ELISA-NU, uma série de várias placas idênticas são preparados que podem ser carregados com cromatina preparada na forma de mononucleosomes. Normalmente, prepare série de idêntica-carregado placas de modo que cada um pode ser sondado com diferentes anti-PTM anticorpos específicos (Abs). Nós também sempre preparar um prato que pode ser sondado com uma Ab que detecta histonas sem levar em conta a sua alteração de controle de carga total do Estado de cromatina. Este controle é essencial para depois comparar quantitativamente o conteúdo PTM de nucleossomos preparados a partir de amostras diferentes. Para quantificar os níveis de PTMs dentro de uma amostra cromatina dado que corrigir os valores de absorbância primas usando esta abordagem: Primeiro, nós subtrair qualquer sinal de fundo usando os valores obtidos a partir de poços de controlo que não contém cromatina (fundo é geralmente insignificante). Em seguida, padronizar PTM específicos sinais para NU-ELISA resultados obtidos a partir de uma placa idêntica carregado que foi ensaiada com Ab que detecta nucleossomos independente de seu estado de modificação. (Nós usamos Abs policlonal específico para histonas H2A ou H2B para esta finalidade). Nós, então, determinar médias e variâncias para cada diluição da cromatina, e utilizar os dados obtidos a partir da porção linear do ensaio ELISA. Exemplos detalhados de NU-ELISA análises matemáticas e estatísticas têm sido relatados anteriormente 4 Figura 1. Esquemática diagam de NU-ELISA passos. Células A. mamíferos são colhidas; Núcleos B. são separados a partir de células por Dounce homogenization, C. Disrupted células são carregadas em cima de uma almofada de sacarose 30% w / v, D. Após a centrifugação, os núcleos são depositados no sedimento; E, F. Chromatin são digeridos in situ para mononucleomes predominantemente por MNase; G, H , eu. mononucleosomes solúveis são extraídos por tratamento hipotônico e centrifugação repetida de material nuclear residual. Mononucleosomes J. a partir de amostras diferentes (rotulado samp. 1 e 2, neste caso) são revestidos em poços da microplaca em série de forma idêntica-carregado com placas e interrogado PTM específicos Abs e PTM independente Abs para determinar o carregamento cromatina total. K. Representação dos níveis de diferencial sinal de detecção em duas amostras que diferem em seu conteúdo PTM, mas tem conteúdo cromatina global semelhante, como julgado por anti-H2B imunorreatividade.