检测采用ELISA法的母语完整的核小体的翻译后修饰

1。哺乳动物细胞培养 NU – ELISA法可以在任何可以在培养的哺乳动物细胞类型。我们宁愿准备适度大批量的细胞，使核小体可以在足够数量的隔离准备几个相同加载的酶标板，从而使与几个不同的抗体（ABS）的检测。下面的文化尺度提供了充足的材料： 对于小鼠embyronic的干细胞，无饲养层细胞生长的细胞的一个或两个15厘米板。对于成纤维细胞，生长5年至10 15厘米板汇合。 2。原子核的隔离注：所有步骤都是冰预冷的缓冲，除特别说明外。 Trypsinize细胞，每盘用3 ml胰蛋白酶结合，并添加20毫升的冰冷的PBS /丁酸。离心5分钟1000转。 重悬细胞于10 ml PBS /丁酸和离心5分钟1000转。 悬浮在与蛋白酶抑制剂（Sigma – Aldrich公司的P – 8340）的细胞裂解液4毫升。 Dounce均质型碓冰乙20招。 在2000克离心10分钟，在4 ° C。 （上清含有细胞质，这是不是本议定书所需要的，但如果需要的话，可以作其他用途，保存）。 悬浮颗粒在2毫升冰冷洗缓冲液C（蛋白酶抑制剂）。 层超过500毫升30％的蔗糖垫的悬浮物质，然后在2400克离心5分钟在一个水平转头。原子核会迁移，通过垫，接口仍然碎片。 仔细删除所有液体的体积和重悬在250μL冰冷的缓冲液洗的C +蛋白酶抑制剂的原子核。 3。核小体的分离在原位微球菌核酸（MNase）消化我们使用在其中染色质内的细胞核注入与MNase，由低渗处理上清液，从而推动了免费的完整的核小体原位消化的过程。 3μL0.1 M的氯化钙样品。放置在37℃加热块。允许承担37 ° C的温度。 新增2台MNase（Sigma – Aldrich公司，微球菌核酸，溶解于2units/10μlMNase缓冲区），然后在37 ° C为12分钟，经常混合使用吸管尖。 加入6μL0.5 M的Na – EDTA，pH值8.0，停止反应。置于冰上。 在2000克离心4分钟，弃上清。 300μL0.2毫米的Na – EDTA重悬沉淀。存放在冰与偶尔的温柔pipeting 1小时。 （这些低渗条件，从原子核中解放出来的自由核小体）。 离心4分钟3000克，在4 ° C。保存上清，其中包含了免费的核小体，在冰上。 悬浮颗粒再次与300μL0.2毫米的Na – EDTA。存放在冰与偶尔的温柔pipeting 1小时。 离心4分钟3000克在4 ° C。保留上清，结合起来，从第5步上清。造成mononucleosome准备可以分装和储存在-80 ° C 注：染色质量可以粗略地通过测量10μL样品在260 nm处的吸光度定量加入到990μL水。 260 = 10（后调整为1 / 100稀释），相当于约染色1mg/ml的。此外，在上述过程中，小样本可能被保留，并为他们的DNA含量分析后监察MNase消化，这主要应包含长度为146 bp的DNA的质量和程度。阶梯是MNase消化不全的指标。 注：图1包含一个核隔离和MNase消化步骤图解摘要。 4。核小体，ELISA（NU – ELISA法） 我们发现含有本机已在96孔酶标微孔板固定完好nuclesosomes分数PTMS。对于每个样本，我们做了一系列的2倍稀释，这些都是到涂井一式三份。 在4 ° 50μL/孔的核小体在涂料缓冲稀释过夜大衣MaxiSorp板建议核小体的序列双重稀释准备从最上面一行的底部行中加入0.1微克，0.05微克，0.025微克，0.0125微克，0.00625微克，0.00313微克，0.00156微克，与涂层的缓冲区，只有在底部（0微克染色）行。 （注：板盖都需要这一步。） 当天上午，洗板200μL/ PBS/0.5％吐温20在室温（RT）的总和为10分钟用洗板机的4倍。 座在室温下1小时与100μL/ PBS/0.05％吐温20 / 5％牛血清白蛋白。 删除轻快地摇晃倒板封闭液在一个水槽。盖上盖子，并储存在-20 ° C的板，或直接进入下一步。 1 · ABS添加量在50μL/ 1:1000以及稀释PBS/0.05％吐温20 / 5％BSA，室温下孵育1小时一个肩（或需要）。 洗净板200μL/ PBS/0.5％吐温20在室温下，在洗板的总和为10分钟的4倍。 加入辣根过氧化物酶（HRP）的共轭2 ° ABS，PBS/0.05％吐温20 / 5％BSA室温下一个小时一个肩稀释1:5000（或需要）。 洗净板与200μL/孔PBS/0.5％Tween – 20的4倍。每次清洗用洗板机在室温下，共10分钟。 在室温为10分钟，加入50μLTMB底物，每口井的开发板。加入50μL/孔的2N H 2 SO 4，停止反应，450 nm处读取的板块。 （提示：2分钟1500转的离心机，使用一盘转子任何气泡​​消散在井前读取吸光度）。 读数导出到电子表格文件，定量和统计分析。 试剂 PBS /丁酸 135 mM氯化钠 2.5 mM的氯化钾 8毫米的Na 2 HPO 4 1.5毫米KH 2 PO 4 10毫米钠丁酸 裂解液 250毫米蔗糖 10毫米的Tris – HCl，pH值7.4 10毫米钠丁酸 4毫米氯化镁2 0.1％的Triton X – 100 洗缓冲液C 250毫米蔗糖 10毫米的Tris – HCl，pH值7.4 10毫米钠丁酸 4毫米氯化镁2 蔗糖垫 30％（W / V）蔗糖在洗涤缓冲液C Microccocal核酸缓冲器 5毫米NAPO 4缓冲液，pH值7.0 0.025毫米氯化钙2 涂料缓冲区 80毫升溶液A +170毫升解决方案的B +250毫升生署2 O 溶液A：0.2 M NA 2 CO 3 B液：0.2 M碳酸氢钠3 5。代表性的成果使用NU – ELISA检测方法，准备与染色质的mononucleosomes形式编写的，它可以载入多个相同的板系列。我们通常会准备一系列的相同装板，使每个人都可以用不同的反PTM（ABS）的特异性抗体探测。我们也随时准备与组蛋白抗体，检测，而不考虑其修改状态总染色质负荷控制，可探测的一个板块。这种控制是必不可少的，为了以后定量PTM的内容从不同的样品制备的核小体进行比较。在一个给定的染色质样品进行定量PTMS的水平，我们正确的原始吸光度值，使用这种方法：首先，我们使用不包含染色质（背景通常是可以忽略不计）从控制井获得的值减去任何背景信号。然后，我们规范的PTM -特定的信号相同装板与独立对其进行修改状态检测核小体的AB检测所得的NU – ELISA法检测的结果。 （我们用于此目的的组蛋白H2A或H2B多克隆ABS）。然后，我们决定为每个稀释的染色质的均值和方差，并用ELISA法检测的线性部分获得的数据。 NU – ELISA法的数学和统计分析的详细的例子有报道先前 4 图1。 NU – ELISA的步骤示意图diagam。 A.哺乳动物细胞的收获; B.细胞核从细胞中分离Dounce homogenization，C.扰乱细胞的30％W / V蔗糖垫，D.离心后的上加载，原子核的颗粒沉积在E，F染色质主要由MNase mononucleomes原位消化，G， H ，我提取可溶性mononucleosomes低渗处理和反复离心剩余的核材料。研究Mononucleosomes从不同的样本（标记桑普在这种情况下，1和2）涂在酶标井系列相同装板和审讯PTM – ABS和PTM -独立的ABS，确定总的染色质加载。K.差分信号的描述在他们的PTM内容不同的两个样品的检测水平，尚未有类似的整体染色质的内容，如反H2B免疫反应来判断。