FRAP a été utilisée pour quantifier la mobilité des protéine de fluorescence verte (GFP)-protéines étiquetées dans les cellules cultivées. Nous avons examiné les fractions mobiles / immobiles de la GFP en analysant le pourcentage de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment. Dans cette étude, le FRAP a été réalisée à épines des neurones de l'hippocampe.
FRAP a été utilisée pour quantifier la mobilité de la GFP-protéines étiquetées. L'utilisation d'un laser d'excitation forte, la fluorescence d'une protéine GFP-étiqueté est blanchi dans la région d'intérêt. La fluorescence de la région récupère lorsque l'écru GFP-protéine marquée de l'extérieur de la région se diffuse dans la région d'intérêt. La mobilité de la protéine est ensuite analysé en mesurant le taux de recouvrement de fluorescence. Cette technique pourrait être utilisée pour caractériser la mobilité des protéines et le taux de roulement.
Dans cette étude, nous exprimons le vecteur (enhanced green fluorescent protein) EGFP dans des cultures de neurones de l'hippocampe. Utilisation du microscope confocal Zeiss 710, nous photobleach du signal de fluorescence de la protéine GFP dans une colonne unique, puis de prendre des images laps de temps pour enregistrer le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment. Enfin, nous estimons que le pourcentage des fractions mobiles et immobiles de la GFP dans les épines, en analysant les données d'imagerie utilisant ImageJ et logiciels Graphpad.
Ce protocole FRAP montre comment effectuer une expérience FRAP base ainsi que la façon d'analyser les données.
Analyse du PAF a été largement utilisée di vivo et di vitro 1-2 études. Cette technique utilise couramment la GFP des protéines de fusion , mais elle pourrait également utiliser les protéines de fusion algue rouge 3. Cette analyse est sensible et peut être utilisée pour caractériser la mobilité des protéines étiquetées GFP.
Pour produire une analyse FRAP sens, il est important d'éviter de photoblanchiment inutiles avant et pendant l'expérience de FRAP. Il ya deux façons d'y parvenir. Premièrement, le processus de rechercher et d'observer les neurones expérimentale devrait être rapide. Surtout, l'observation des neurones avec un objectif 100X pour une longue période blanchit de manière significative la fluorescence. Deuxièmement, la puissance du laser à balayage élevée et fréquente souvent à accroître la possibilité de photoblanchiment. Ainsi, il sera nécessaire de calculer le taux de photoblanchiment dans une région de contrôle puis de normaliser la courbe du PAF dans la région expérimentale. La méthode de normalisation a été décrite dans le protocole (voir l'étape 3.3 à 3.5 pour plus de détails).
L'étape photoblanchiment est également essentielle pour assurer des résultats FRAP bon. Dans cette expérience, nous avons l'eau de Javel de la colonne vertébrale d'intérêt 10 fois à 100% de transmission laser. Cette condition est suffisante pour blanchir la fluorescence d'une colonne vertébrale au niveau de base dans une préparation fixée. Ainsi, nous avons mis de l'intensité de fluorescence pour le même nombre que de fond à 0 secondes après photoblanchiment. Selon la vitesse de la première analyse, une quantité importante de récupération de fluorescence peut-être déjà détecté lors de la protéine d'intérêt est très mobile.
Beaucoup de sondes protéine fluorescente ont été développées pour étudier la dynamique des protéines avec des FRAP. Une approche complémentaire est, par exemple, d'utiliser la GFP photoactivables (PA-GFP), ou des variantes photoconvertible. Ensemble, avec la technique du FRAP, ces outils deviennent indispensables pour vivre des études d'imagerie cellulaire 4-6.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l'Institut national sur la surdité et autres troubles de communication (NIDCD) programme intra-muros.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |