FRAP נעשה שימוש כדי לכמת את הניידות של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתויג חלבונים בתאים בתרבית. בדקנו את השברים הנייד / נייח של ה-GFP על ידי ניתוח שחזור אחוז הקרינה לאחר photobleaching. במחקר זה, FRAP בוצעה על עמוד השדרה של נוירונים בהיפוקמפוס.
FRAP נעשה שימוש כדי לכמת את הניידות של ה-GFP-tagged חלבונים. באמצעות לייזר עירור חזק, הקרינה של חלבון ה-GFP-תייג הוא מחומצן באזור של עניין. הקרינה של האזור מתאושש כאשר חלבון מולבן GFP-tagged מבחוץ האזור מתמוסס לתוך האזור של עניין. ניידות של החלבון הוא ניתח אז על ידי מדידת קצב התאוששות פלואורסצנטי. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לאפיין ניידות חלבון התחלופה.
במחקר זה, אנו מביעים את וקטור (משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק) EGFP של נוירונים בהיפוקמפוס תרבותי. באמצעות מיקרוסקופ Zeiss 710 confocal, אנו photobleach את האות פלואורסצנציה של חלבון ה-GFP בעמוד השדרה אחת, ולאחר מכן לקחת זמן לשגות תמונות כדי להקליט את ההתאוששות לאחר photobleaching פלואורסצנטי. לבסוף, אנו מעריכים את אחוז שברים ניידים תנועה של ה-GFP של עמוד השדרה, על ידי ניתוח נתוני הדמיה באמצעות ImageJ ותוכנות Graphpad.
זה פרוטוקול FRAP מראה כיצד לבצע ניסוי FRAP בסיסי וכן כיצד לנתח את הנתונים.
ניתוח FRAP נעשה שימוש רחב in vivo ו in vitro 1-2 ללימודים. טכניקה זו בדרך כלל מנצל GFP חלבונים היתוך , למרות שזה יכול גם להשתמש באדום חלבונים אצה היתוך 3. ניתוח זה הוא רגיש והוא יכול לשמש כדי לאפיין את הניידות של ה-GFP-tagged חלבונים.
כדי לייצר ניתוח FRAP משמעותי, חשוב להימנע photobleaching מיותר לפני ובמהלך הניסוי FRAP. ישנן שתי דרכים להשיג זאת. ראשית, תהליך לחפש ולבחון את נוירון ניסיוני צריכה להיות מהירה. במיוחד, תצפית של נוירונים עם מטרה 100x במשך תקופה ארוכה באופן משמעותי את הקרינה הלבנה. הכוח השני, לייזר גבוהה סריקה תכופות לעתים קרובות להגדיל את האפשרות של photobleaching. לפיכך, יהיה צורך לחשב את שיעור photobleaching באזור שליטה ואז לנרמל את עקומת FRAP באזור הניסוי. שיטת נרמול תוארה בפרוטוקול (ראה שלב 3.3-3.5 לפרטים נוספים).
הצעד photobleaching גם קריטי להבטחת תוצאות FRAP טוב. בניסוי זה, אנו להלבין את עמוד השדרה של הריבית 10 פעמים ב שידור לייזר 100%. מצב זה מספיק כדי להלבין את הקרינה של עמוד השדרה לרמה רקע כהכנה קבוע. לפיכך, אנו קובעים את עוצמת הקרינה למספר זהה רקע על 0 שניות לאחר photobleaching. תלוי במהירות הסריקה הראשונה, כמות משמעותית של התאוששות הקרינה עלולה להתגלות כבר כאשר החלבון של הריבית ניידים מאוד.
רבים בדיקות חלבון פלואורסצנטי פותחו ללמוד הדינמיקה חלבון עם FRAP. גישה משלימה היא, למשל, להשתמש photoactivatable GFP (PA-GFP), או גרסאות photoconvertible. יחד עם טכניקה FRAP, כלים אלה הופכים הכרחי לחיות הדמיה מחקרים תא 4-6.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (NIDCD) תוכנית עירונית.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |