FRAP была использована для количественного мобильность Зеленый флуоресцентный белка (GFP), помеченные белков в культуре клеток. Мы рассмотрели мобильных / неподвижные доли GFP путем анализа флуоресценции процент выздоровления после фотообесцвечивания. В этом исследовании, FRAP была выполнена на шипы нейронов гиппокампа.
FRAP была использована для количественной оценки подвижности GFP с метками белков. Использование сильного лазерного возбуждения флуоресценции GFP с метками белка отбеливается в области интереса. Флуоресценции области восстанавливается при небеленой GFP с метками белка из-за пределов региона диффундирует в область интересов. Подвижность белка затем анализируется путем измерения флуоресценции скорость восстановления. Этот метод может быть использован для характеристики подвижности белка и текучести кадров.
В этом исследовании, мы выражаем (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) EGFP вектор в культуре нейронов гиппокампа. Использование Zeiss 710 конфокальной микроскопии, мы photobleach флуоресценции сигнал GFP белка в одном позвоночника, а затем получать изображения промежуток времени для записи флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания. Оценим, наконец, процент подвижных и неподвижных доли GFP в шипы, на основе анализа данных с использованием изображений ImageJ и GraphPad программного обеспечения.
Этот протокол FRAP показано, как выполнять основные эксперимент FRAP, а также, как анализировать данные.
FRAP анализ был широко используются в естественных условиях и в пробирке 1-2 исследований. Эта техника широко использует GFP слитых белков , хотя она может также использовать красные водоросли белков слияния 3. Этот анализ чувствительны и могут быть использованы для характеристики мобильности GFP с метками белков.
Для получения полноценного анализа FRAP, важно, чтобы избежать ненужных фотообесцвечивания до и во время FRAP эксперимента. Есть два пути для достижения этого. Во-первых, процесс поиска и наблюдения экспериментальных нейрон должен быть быстрым. В частности, наблюдения нейронов с 100X цель в течение длительного времени значительно отбеливает флуоресценции. Во-вторых, высокая мощность лазерного сканирования и частые часто увеличивают возможность фотообесцвечивания. Таким образом, необходимо будет рассчитать фотообесцвечивания ставка в контрольной области, а затем нормализовать FRAP кривой в экспериментальной области. Нормализации метод был описан в протоколе (см. шаг 3.3-3.5 право).
Фотообесцвечивания шаг также решающее значение для обеспечения хороших результатов FRAP. В этом эксперименте мы отбеливателя позвоночника интерес в 10 раз при 100 передачи лазерного%. Это условие является достаточным, чтобы отбелить флуоресценции позвоночника к фоновому уровню в фиксированном подготовки. Таким образом, мы устанавливаем интенсивности флуоресценции на тот же номер в качестве фона на 0 секунд после фотообесцвечивания. В зависимости от скорости первого сканирования, значительное количество флуоресценции восстановления, возможно, уже обнаружена, когда белок является очень мобильны.
Многие флуоресцентных зондов белка были разработаны для изучения динамики белков с FRAP. Дополнительный подход является, например, использовать фотоактивируемых GFP (PA-GFP), или photoconvertible вариантов. Вместе с FRAP техники, эти инструменты становятся необходимыми для живой клетки диагностическая визуализация 4-6.
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Национального института глухоты и других расстройств связи (NIDCD) Внутренние программы.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |