NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques
Summary
L'utilisation de systèmes microvolume NanoDrop comme des alternatives concrètes et efficaces pour méthode traditionnelle d'acide nucléiques quantification est décrite à travers la démonstration de deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acides.
Abstract
Dosages biomoléculaire sont continuellement développés qui utilisent des quantités progressivement plus petites de matériel, souvent obstacle à l'utilisation de la cuvette conventionnelle basée sur des instruments de quantification d'acides nucléiques pour ceux qui peuvent effectuer une quantification microvolume.
Le système de rétention NanoDrop microvolume échantillon (Produits Thermo Scientific NanoDrop) en combinant les fonctions technologie des fibres optiques et les propriétés naturelles tension de surface pour capturer et retenir des quantités infimes d'échantillon indépendant de l'appareil de confinement traditionnels tels que les cuvettes ou capillaires. Par ailleurs, le système utilise la longueur des trajets plus courts, ce qui résulte dans une large gamme de mesures de concentration d'acide nucléiques, éliminant la nécessité d'effectuer des dilutions. Réduire le volume d'échantillon requis pour l'analyse spectroscopique facilite également l'inclusion d'autres étapes de contrôle qualité tout au long de nombreux flux moléculaire, augmentant l'efficacité et conduisant finalement à une plus grande confiance dans les résultats en aval.
La nécessité d'une haute sensibilité d'analyse de fluorescence de masse limitée est également apparu avec les récentes avancées expérimentales. Utilisant la même technologie microvolume de rétention de l'échantillon, les mesures de fluorescence peut être réalisée avec 2 pi de matériel, permettant des dosages fluorescents exigences de volume pour être sensiblement réduits. Ces microréactions de 10 uL ou moins sont désormais possibles en utilisant une fluorospectrometer dédié microvolume.
Deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acide sera démontré que l'utilisation de systèmes intégrés de conservation de l'échantillon comme des alternatives aux pratiques traditionnelles cuvette des protocoles. D'abord, une méthode directe A260 d'absorbance avec un spectrophotomètre microvolume est décrite. Elle est suivie par une démonstration d'une méthode de fluorescence qui permet aux volumes réduits réactions de fluorescence avec un fluorospectrometer microvolume. Ces nouvelles techniques permettent l'évaluation des concentrations d'acides nucléiques allant de 1 pg / uL à 15.000 ng / uL avec une consommation minimale de l'échantillon.
Protocol
Discussion
Les protocoles de quantification présentées ici sont basées sur les systèmes les plus largement acceptées microvolume. Ces systèmes fournissent des solutions de rechange pratique pour méthode traditionnelle d'acide nucléiques quantification, qui reposent sur des volumes d'échantillon plus grande et l'utilisation d'appareils de confinement.
NanoDrop microvolume technologie utilise un système de rétention d'échantillon qui s'appuie sur les propriétés de tension superficielle de l'échantillon mesuré pour former une colonne liquide. Il est essentiel que l'échantillon est en contact avec les surfaces supérieures et inférieures de mesure optique pour la formation de la colonne appropriée. Si à tout moment les résultats de mesure semblent inexactes ou non reproductibles, il est probablement le résultat de l'hétérogénéité de l'échantillon ou le bris de colonne liquide.
Détergents et d'alcool isopropylique ne sont pas recommandés agents de nettoyage, car ils peuvent incondition les surfaces de mesure piédestal. Un piédestal inconditionnée se produit lorsque les propriétés de surface hydrophobe du piédestal a été compromise, ce qui entraîne un aplatissement de la goutte d'échantillon. Socles Inconditionné peut conduire à la rupture de la colonne de liquide pendant le mesurage.
Surface de la figure 3. Inconditionné est caractérisée par un aplatissement d'une goutte d'eau.
Surfaces piédestal Uncondtioned peut être reconditionné en utilisant le composé piédestal NanoDrop reconditionnement (PR-1, Thermo Scientific Products NanoDrop). Une fine couche de composé reconditionnement est appliqué sur les surfaces supérieures et inférieures piédestal, on laisse sécher pendant environ 30 secondes, puis déteint l'aide d'un endroit propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. Un état avec succès reconditionnés est caractérisée par une gouttelette d'eau perlant place lorsqu'il est appliqué à la surface piédestal bas.
Figure 4. Une surface reconditionnés est caractérisée par un perlage d'une goutte d'eau.
Systèmes de quantification microvolume réduire considérablement la consommation de l'échantillon et augmenter considérablement la gamme de concentration par rapport aux systèmes quantification plus traditionnels. Bien que la quantification microvolume est souvent devenu une technologie habilitante pour des circonstances impliquant la masse cellulaire limitée tels que biopsies à l'aiguille et le laser capture microdissection, l'efficacité et la facilité d'utilisation de cette méthodologie a fait largement accepté alternative aux méthodes de quantification d'acides nucléiques, même lorsque l'échantillon est abondante.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Richard W. Beringer et David L. Ash, scientifiques applications, produits Thermo Scientific NanoDrop, d'assistance technique et de tournage.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | ||
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific | ND-3300 |
Riferimenti
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474-481 (1997).
- Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note. , (2006).
- Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. . Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).
- Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).
