1. Extracción de ARN: las células cultivadas en monocapa (Siguiendo el protocolo del fabricante utilizando TRIzol.) Nombre del reactivo Empresa Prod. / Cat # TRIzol solución Invitrogen 15596-018 El alcohol isopropílico Sigma-Aldrich 1907-1964 Cloroformo Sigma-Aldrich C 2432 Etanol RNasa libre de agua Homogeneización Homogeneizar las células directamente en la placa de cultivo mediante la adición de 1 ml Solución Trizol por cada 10 cm plato área 2, la forma de remolino alrededor de Trizol y la pipeta hacia arriba y abajo para asegurar una cobertura completa de la placa. Fase de separación Incubar la muestra homogeneizada por 5 minutos a temperatura ambiente. Transferencia en un tubo etiquetado, añadir 0,2 ml de cloroformo por 1 ml TrizolSolution y agitar el tubo enérgicamente a mano durante 15 segundos. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 15 minutos a 2 ° C. Después de la centrifugación de la mezcla se separa en una fase inferior de color rojo, una interfase y una fase superior acuosa incolora, que contiene el ARN y debe ser de 60% del volumen total de solución de Trizol. Precipitaciones ARN La transferencia de la fase acuosa, que contiene ARN de fase en un tubo nuevo y rotulado. Precipitar el ARN mediante la adición de 0,5 ml de alcohol isopropílico por 1 ml de solución de Trizol. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar a 12.000 xg durante 10 minutos a 2 ° C. ARN de lavado Tras la centrifugación, descartar el sobrenadante de los tubos. Lavar el pellet de ARN (en el lateral y parte inferior del tubo) mediante la adición de al menos 1 ml de etanol al 75% por cada 1 ml de solución de Trizol, vórtice. Centrifugar a 7500 xg durante 5 minutos a 2 ° C. ARN de elución Descartar el sobrenadante y se centrifuga de nuevo durante 1 minuto. Extraer el líquido excesivo. Aire seco en pelets durante 5-10 minutos. Nota: más seca ARN es difícil de solubilizar. Volver a disolver el precipitado en RNasa libre de agua al vaso de la solución hacia arriba y hacia abajo y se incuba durante 10 minutos a 55 ° C. Medir la concentración de ARN (A260/280 ratio) usando un espectrofotómetro ™ Nanodrop. Almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su uso. 2. Extracción de ARN: Suero (Después de protocolo Mirvana PARIS fabricante de Kit modificado por Mitchell et al. 1) Nombre del reactivo Empresa Prod. / Cat # Comentarios mir Vana PARIS Kit Solución 2X desnaturalización Ácido fenol: cloroformo miRNA una solución de lavado miRNA solución de lavado 03.02 Ambion AM1556 Protocolo modificado 2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich M7522 Etanol DEPC agua tratada Químicos de preparación: Añadir 375 l de 2-mercaptoetanol a la solución de 2X desnaturalización y mezclar bien. Añadir 21 ml de etanol al 100% a la solución de lavado miRNA 1. Añadir 40 ml de etanol al 100% a la solución de lavado miRNA 2 / 3. Preparación de la muestra: Descongelar una muestra de suero en el hielo. Homogeneización Mezcla de muestra de 300 ml con un volumen igual (300 l) de la solución de 2X desnaturalización (debe estar a temperatura ambiente) y agitar. Incubar la mezcla en hielo durante 5 minutos. Añadir un volumen de ácido fenol: cloroformo igual al volumen total de lisado muestra más de la solución 2X desnaturalización (600 l). Importante: No utilice el tampón acuoso que se encuentra en la parte superior del ácido fenol: cloroformo. Vortex mezcla durante 60 segundos. Se centrifuga a temperatura ambiente durante 15 minutos a velocidad máxima (> 10.000 xg). Después de la centrifugación de la mezcla se separa en una fase acuosa superior, interfase y una fase orgánica inferior. Eliminar aquecapa de las unidades organizativas en la parte superior (en caso de ser 300 a 500 l incluyendo cualquier proteico "nebulosa" de la capa). Volver a extraer la capa acuosa como antes, por una vez más la adición de cloroformo. Importante: La capa acuosa de la segunda extracción es habitualmente más pequeño en volumen (250 l). Tenga en cuenta el volumen recuperado. Preparación de la final de ARN de aislamiento (ARN total) Pre-caliente (95 ° C) agua libre de nucleasa. 100% de etanol debe estar a temperatura ambiente. Final de ARN de aislamiento (ARN total) Añadir 1,25 volúmenes de etanol al 100% a la fase acuosa recuperada (por ejemplo, si 300 l se recuperó, añadir 375 l de etanol) y mezclar bien. Para cada muestra, colocar un cartucho de filtro en uno de los tubos de recolección. Pipeta el lisado en el filtro. Centrífuga (10.000 xg) durante 30 segundos, desechar el flujo a través, centrifugar de nuevo durante 30 segundos y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el tubo de la misma colección. ARN-Wash Aplique la solución 700 l Lávese las miRNA 1 en el cartucho de filtro y centrifugar durante 15 segundos, desechar el flujo a través del tubo de recolección, y reemplazar el cartucho de filtro en el tubo de la misma colección. Aplique la solución 500 l Lávese las miRNA 2 / 3, centrifugar durante 15 segundos, desechar el filtrado y repetir con un segundo 500 l de solución de lavado 2 / 3. Deseche el filtrado y centrifugado en seco durante 1-2 minutos. Coloque el cartucho de filtro en un tubo de recogida de fresco, aplicar 100 l de RNasa libre de agua (95 ° C), tapa de cierre y se incuba durante 2 minutos. Centrifugar durante ~ 2 minutos para recuperar el ARN. Almacenar a -80 ° C hasta su uso. 3. Concentración de ARN de la solución (5 veces) (Siguiendo el protocolo del fabricante) Nombre del reactivo Empresa Prod. / Cat # Microcontrolador centrífugas dispositivos de filtro, Ultracell YM-3 Millipore 42404 DEPC agua tratada Dispositivo: Microcon Ultracell YM-3, SS de corte y nucleótidos DS: 10 Volumen: El volumen deseado de la re-solución concentrada de ARN depende del diseño experimental y debería incluir el control de experimentos. Inserte depósito Microcon muestra en el vial y la solución de la pipeta en el depósito. Nota: No toque la membrana. Centrifugar durante 185 minutos a 4 ° C, con máxima 14.000 x g. Nota: Posición vial con la banda de romper hacia el rotor. Volumen de la pipeta deseada de RNasa libre de agua (por ejemplo, 20 l) en el embalse, depósito lugar invertido en un nuevo vial y vuelta durante 3 minutos a 4 ° C con máximas g. x 3000 Almacenar a -80 ° C hasta su uso. 4. La transcripción inversa (Después de un protocolo por Tang et al. 2 con algunas modificaciones.) Nombre del reactivo Empresa Prod. / Cat # Comentarios Alta capacidad de cDNA kit Archivo 10x Buffer cDNA archivo dNTP (100 mM) Murina Moloney virus de la leucemia (MMLV) de la transcriptasa inversa (50 U / l) Applied Biosystems 4368814 protocolo modificado RNaseOUT (40 U / l) Invitrogen 10777019 x compleja inversa tallo-bucle cartilla mezcla (40 Nm) * Integrado las tecnologías de ADN Costumbre Secuencias * DEPC agua tratada Volumen de reacción: 5,5 l Nota: la concentración final de los cebadores de tallo-bucle debe ser de 1-5 nM (en este caso 2 nM). Prepare Master-Mix (volúmenes por reacción) de la siguiente manera: 1. DEPC-agua 1.959 l 2. 10x RT-Buffer 0,55 l 3. Inhibidor de la RNasa (40 U / l) 0,0715 l 4. dNTP (100 mM) 0.275 l 5. x compleja inversa tallo-bucle cartilla mezcla (40 Nm) * 0.275 l 6. MMLV-RT (50 U / l) 0.369 l Mix y una breve centrifugación. Añadir 3,5 l Master-Mix a 2 l de la muestra. Realizar las siguientes RT-reacción: 16 ° C durante 30 minutos, seguido por 60 ciclos a 20 ° C durante 30 segundos, 42 ° C durante 30 segundos, 50 ° C durante 1 segundo y 85, finalmente ° C durante 5 minutos para inactivar MMLV-RT, 4 ° C ∞ . Almacenar a -20 ° C hasta su uso. * Lista de revertir tallo-bucle primers se puede encontrar en http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 5. Pre-Amplificación (Pre-PCR) (Después de un protocolo por Tang et al. 2 con algunas modificaciones.) Nombre del reactivo Empresa Prod. / Cat # Comentarios dNTP (100 mM) Applied Biosystems 4368814 De gran capacidad. Kit archivo cDNA. 2x PCR Universal Master Mix con NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 x compleja mezcla de cebadores hacia adelante (450 Nm) * Integrado las tecnologías de ADN Costumbre Secuencias * Primer universal inversa (100 M) Integrado las tecnologías de ADN Costumbre Secuencia 2 Polimerasa AmpliTaqGold (5 U / l) Applied Biosystems 4311806 MgCl 2 (100 mM) DEPC agua tratada Volumen de reacción: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-producto) Nota: Pre-amplificación es necesaria para mejorar la potencia de la señal, sobre todo cuando la concentración inicial de ARN es limitado. El nivel de entrada de ARN determina el número óptimo de pre-PCR de los ciclos. Teniendo en cuenta la eficiencia relativa de cada ciclo de PCR mismo debe el doble de la concentración del producto final. Dado que algunos miRNAs será más alta expresión, evitar el exceso de ciclismo. Sin embargo, bajo la amplificación puede resultar en una pérdida de sensibilidad de detección, sobre todo de micro ARNs expresa en niveles bajos. En nuestras manos 12 ciclos de amplificación previa, utilizando 100 ng de ARN total, parecía ser suficiente. Utilizando suero como materia prima, 12 ciclos de los resultados en los niveles de miRNA detectable, pero de 15 ciclos que parecía ser superior. Finalmente, a partir de 3 ovocitos (alrededor de 400 pg de ARN total por ovocito 3), 16 ciclos de amplificación con éxito antes de que nos permite detectar los niveles de expresión de microARN 4. * Lista de adelante se puede encontrar en http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Prepare Master-Mix (volúmenes por reacción) de la siguiente manera: 1. 2x universal MM 13,75 l 2. DEPC-agua 0.792 l 3. MgCl 2 (100 mM) 0,55 l 4. dNTP (100 mM) 1,1 l 5. x compleja mezcla de cebadores hacia adelante (450 nm) 3,06 l 6. Universal de RP (100 M) L 1.375 7. Polimerasa AmpliTaqGold (5 U / l) L 1.375 Mezclar y centrifugar brevemente. Agregar 22 l Master-Mix de cada 5,5 l de RT-producto. Realizar las siguientes pre-PCR de la reacción: 95 ° C durante 10 min, 55 ° C durante 2 minutos, seguido de 10 a 18 ciclos de 95 ° C durante 1 s, y 65 ° C durante 1 minuto, 4 ° C ∞. 6. La purificación del producto Pre-PCR La purificación por la selección del tamaño en un gel de poliacrilamida al 10% de nativos Nombre del reactivo Empresa Prod. / Cat # 40% de acrilamida / Solución Bis Bio-Rad 161-0144 TEMED Bio-Rad 161-0801 10 pb escalera del ADN Invitrogen 10821-015 SYBR oro gel de ácido nucleico mancha 10000 X se concentran en DMSO Invitrogen S11494 Glucógeno (20 mg / ml) Roche 10 901 393 001 Buffer-EB 10% Ammoniumpersulfate (APS) RTE-Buffer 6x G Naranja DEPC agua tratada ddH2O a. Gel de preparación Para hacer 10 ml de una mezcla de poliacrilamida al 10% adicional 1. ddH2O 6,5 ml 2. TBE 10x 1 ml 3. Poliacrilamida (40%) 2,5 ml 4. APS (10%) 80 l 5. TEMED 4 l Prepare escalera del ADN: 0,5 l de 10 pb escalera del ADN 4,5 l de búfer (EB) 1 l 6x G Naranja Añadir 5,5 l 6x Orange G a cada uno de 27,5 l Pre-PCR producto. b. Corra el gel Corra el gel con 150 V de 55 a 60 minutos. Nota: Azul de bromofenol como indicador funciona con la región 20bp. c. Tinción de Gel Mancha de gel con SYBR-Gold durante 25 minutos en la coctelera. Nota: SYBR-Gold es sensible a la luz. d. Corte Gel Recorte de pre-PCR de productos de banda 60 a 80 pb y traslado al tubo rotulado. Nota: Una banda de bajos ARN de entrada Pre-PCR podría no ser visible. Aplastar a la banda de gel (por ejemplo, en tubos de centrifugación del tubo). e. Re-Extracto de cDNA Añadir 300 l de la RTE-Buffer y se incuba a 37 ° C durante 4 horas en un rotor. La transferencia de fluidos a un tubo de recogida de etiquetado, añadir otro l 300 de la RTE-Buffer al tubo que contiene el gel e incubar todos a 4 ° C durante la noche en un rotor. Aspirar el líquido residual, la transferencia en el tubo de extracción etiquetados como antes y anotar el volumen total recuperado. f. Precipitaciones etanol Añadir 3 volúmenes de etanol a temperatura ambiente 100%. Añadir 0,5 l de glucógeno (20 mg / ml). Vortex. Incubar en hielo seco durante al menos 2 horas o de -80 ° C durante la noche. Girar en microcentrífuga a 4 ° C durante 30 minutos para que sedimenten cDNA. Volcar el líquido, añadir 700 temperatura ambiente l 75% de etanol y girar durante 10 minutos. Volcado de líquidos y girar de nuevo durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante sin perturbar pellet y secar al aire durante 10 minutos. Volver a disolver el precipitado en agua limpia. Nota: El volumen deseado de solución concentrada de cDNA depende del diseño experimental y debería incluir el control de experimentos. 7. La purificación del producto Pre-PCR La purificación por digestión enzimática de los primers seguido de spin columna (siguiendo los protocolos de fabrica) Nombre del reactivo Empresa Prod. / Cat # ExoSAP-IT USB-Affymetrix 78250 MinElute PCR kit de purificación Qiagen 28004 Nota: en nuestras manos la exclusiva enzimática de limpieza primers eliminado con éxito sino que también condujo a la degradación parcial de los productos pre-amplificación, posiblemente parcial, debido a la desnaturalización de los productos a corto como la temperatura se eleva hasta 80 ° C durante el paso de inactivación de la enzima. Evitar la inactivación térmica directa y purificación de los productos PCR de la reacción enzimática con columnas de centrifugado elimina cualquier imprimación, sin degradación del producto. Mezclar 5 l post-PCR producto con 2 l ExoSAP-IT. Se incuba a 37 ° C durante 15 minutos para degradar cebadores y nucleótidos restantes. Añadir 5 volúmenes de tampón PB a 1 volumen de la reacción de PCR y la mezcla, si el indicador de pH que se ha añadido a Buffer PB, comprobar que el color de la mezcla es de color amarillo. Coloque una columna MinElute en un tubo de recogida de siempre 2 ml en un estante adecuado. Aplicar la muestra a la columna MinElute y centrifugar durante 1 minuto. Deseche de flujo continuo, el lugar de la columna MinElute de nuevo en el mismo tubo y añadir 750 l Buffer PE a la columna MinElute de lavar y centrifugar durante 1 minuto. Desechar el filtrado y coloque la columna MinElute en el mismo tubo. Centrifugar la columna durante 1 minuto a velocidad máxima. Colocar la columna en un lugar limpio MinElute 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Para eluir el ADN, añadir 10 l de agua tratada con DEPC al centro de la membrana, que la columna de reposar durante 1 minuto, y luego el CENtrifuge durante 1 minuto. 8. Fludigim 96,96 QRT-PCR perfiles Nombre del reactivo Empresa Prod. / Cat # Comentarios Fluidigm 96.96 Kit matriz dinámica 96,96 matriz dinámica 96,96 control de fluidos línea 20x de carga de reactivos Fluidigm Corporación Mezcla de Universal cebador inverso (1 M) Primer avance (1 M) Sonda TaqMan (0,2 M) Integrado las tecnologías de ADN Costumbre Secuencia (1) 2x PCR Universal Master Mix con NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 Tween 1. Cebado de la IFC 96,96 matriz dinámica Inyectar fluido de control de línea (150 l) en cada uno de los acumuladores en el chip. Chip en lugar de la CFI (circuito integrado de fluidos) y ejecutar el controlador de Prime (136x) script para fluidos primera línea de control en el chip. Nota: Chip debe utilizarse 24 horas después de abrir el paquete. Asegúrese de no derramar el líquido de la línea de control desde la línea de control de fluidos en el chip o en las entradas hace que el chip inutilizable. Chips se debe cargar en 60 minutos de preparación. 2. Preparación de las muestras 2.1 Pre-Preparación de la muestra En un tubo de plástico desechables, se combinan los elementos de la tabla de abajo para hacer la muestra-Pre-Mix (volúmenes por entrada). 2x TaqMan Universal Master Mix 2,5 l 20x de carga de reactivos 0,25 l Nota: El volumen final es de 2,75 l, como exceso de pipeta de prescindir de las pérdidas 2.2-Preparación de la muestra Combine en el 96 y el formato de cada muestra con una mezcla de pre-muestra (volúmenes por entrada). Pre-Sample-Mix 2,75 l Muestra 2,25 l Nota: Vortex y centrifugar 96 pocillos brevemente para recoger el líquido. Volumen final por entrada de 5 l, tome en cuenta la pérdida de pipeteado mediante la preparación de un volumen ligeramente superior. 2.3 Preparación de los ensayos de 13x Use una placa de 96 pocillos para preparar ensayos de 13x. 1x concentraciones en la siguiente tabla, la escala para 13x. Cebador inverso universal 1 micra (1x) Secuencia en dos * Primer avance 1 micra (1x) * Genes específicos de la sonda TaqMan # 0,2 micras # * Lista de adelante se puede encontrar en http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Lista N º de sondas TaqMan se puede encontrar en http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Combine en una nueva placa de 96 alícuotas y de los ensayos de 13x con Tween, para una concentración final de Tween 0,25% Nota: El volumen final por entrada es de 5 l, preparar un volumen suficiente (5,5 l) para tomar la pérdida durante el traslado de volumen en cuenta. Mezclar bien, evitando las burbujas y centrifugar brevemente para recoger el líquido. 3. Cargando el chip Nota: A fin de permitir la carga correcta de las muestras y ensayos de garantizar la correcta colocación del chip. Es conveniente alinear la muesca en la esquina superior izquierda. Asegurar que todos los análisis y las muestras se mezclan antes de cargar el chip. Es conveniente hacer esto en una placa de 96 pocillos y girar el plato antes de cargar el chip. Tenga en cuenta el mapa de chip de pipeteo para su posterior consulta. Las entradas no utilizadas de la muestra debe ser llenado con 2,75 l Mezclar la muestra y 2,25 l de agua libre de ADN. Las entradas no utilizadas del análisis deben ser llenados con 2,5 l de reactivo de carga de ensayo y 2,5 l de agua. No vaya más allá de la primera parada, mientras que pipeteado para evitar la introducción de burbujas de aire. Después de cargar las muestras y ensayos (Volumen por entrada: 5 l) ejecutar el script de carga Mix (136x) script para cargar las muestras y los ensayos en el chip. Después de que el script termine, quite el chip de la controladora ICF. Pelar la película protectora azul de la parte inferior del chip de carga. Eliminar cualquier partícula de polvo o suciedad de la superficie del chip. 4. 96,96 QRT-PCR Transferir el chip para el sistema Biomark y el uso de las siguientes condiciones de la ampliación: 55 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 55 º C durante 1 min. Siga el protocolo de fabricación para la recolección de datos de software. 5. Utilizando el software de análisis qPCR Después de RT-PCR el software propietario ofrece curvas de amplificación, mapas de calor y los valores de Ct para cada pozo. Por favor, consulte el manual de software para análisis de datos. 9. Los resultados representativos: Figura 1. Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. Se muestra una descripción paso a paso de la QRT-PCR multiplex protocolo, incluyendo la purificación (etapa e) de los cebadores excesivo de la transcripción inversa multiplex (Paso C) y preamplificación multiplex (Paso D), antes de detección en tiempo real (Paso F), lo que resulta en una plantilla de cDNA purificado de QRT-PCR. FP: microARN específicos cebador, URP: invertir primer universal, R-SLP: microARN específicos inversa tallo-bucle de imprimación. Haga clic aquí para ampliar la imagen. Figura 2. . Purificación en gel Polyacryamide de la plantilla de QRT-PCR después de pre-PCR bandas del tamaño del producto pre-PCR se observa exclusivamente en las muestras de WT, pero no en DGCR8 microARN deficiente – / – o Dicer – / – después de las muestras (flechas) 96-plex RT y 12 ciclos de preamplificación. Tenga en cuenta que productos no específicos de origen desconocido (puntas de flecha) y cebadores excesiva se encuentran en todas las muestras (las estrellas). Figura 3. Purificación después de preamplificación multiplex mejora enormemente la precisión de QRT-PCR resultados a) Comparación de los niveles relativos de expresión de WT MESC a DGCR8 -. / – (MicroRNA canónica deficiente) MESC revela 1) la detección de más microARN y 2) la pérdida de falsos positivos señales en DGCR8 – / – fondos tras purificar lejos primers del producto pre-PCR. b) Después de la purificación, los niveles relativos de expresión de ambos DGCR8 – / – / WT y Dicer – / – / Peso muestran una pérdida de señales de falsos positivos y permitir una clasificación adecuada de rara DGCR8 independiente / Dicer pequeños ARN dependiente (miR-320, – 484, -877) 5. Figura 4. Fluidigm de alto rendimiento de QRT-PCR perfiles de miRNA. Ejemplo de captura de pantalla de 96,96 Fluidigm QRT-PCR perfiles mircoRNA para la detección de alteraciones en los niveles de miRNA de suero de próstata paciente con cáncer. El software qPCR análisis en tiempo real proporciona curvas de amplificación, mapas codificados por color y calor ciclo umbral (Ct).
