Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node
Summary
Eine Technik für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten (LN) wird skizziert. Solche Technik ermöglicht in Echtzeit,<em> In vivo</em> Studium der Lymphknoten Mikrovaskulatur und Struktur sowohl während der Homöostase und Infektionen. Diese Technik kann die Zelle des Menschenhandels Studien und andere Lymphknotenstationen angepasst werden.
Abstract
Lymphknoten (LN ist), im ganzen Körper befinden, sind ein integraler Bestandteil des Immunsystems. Sie dienen als Ort für die Induktion der adaptiven Immunantwort und damit die Entwicklung von Effektorzellen. Als solche sind LNs Schlüssel zur Bekämpfung von eindringenden Krankheitserregern und Erhaltung der Gesundheit. Die Wahl des LN zur Studie wird von Zugänglichkeit und das gewünschte Modell diktiert, die inguinalen Lymphknoten ist gut gelegen und leicht unterstützt Studien von biologisch relevanten Modelle von Haut-und Schleimhaut-genitale Infektion.
Die inguinalen LN, wie alle LNS, verfügt über ein umfangreiches Netzwerk mikrovaskuläre Versorgung mit Blut. In der Regel enthält diese mikrovaskulären Netzwerk der wichtigsten Futtermittel Arteriole der LN, die später Zweige und hohe Venolen (HEV) speist. HEVs sind zur Erleichterung des Handels von Immunzellen in der LN während der beiden Homöostase und Infektionen spezialisiert. Wie HEVs regulieren Menschenhandel in die LN im Rahmen dieser beiden Umstände ist ein Gebiet intensiver Forschung. Die LN-Feeds Arteriole, hat einen direkten Einfluss auf die vorgelagerten HEVs und ist der wichtigste Nährstoff-und Zell-reiches Blut in den LN. Darüber hinaus werden Änderungen im Futter Arteriole bei der Erleichterung Induktion der adaptiven Immunantwort beteiligt. Die LN Mikrovaskulatur hat offensichtliche Bedeutung in der Aufrechterhaltung einer optimalen Durchblutung der LN und Regulierung von Immunzellen Einstrom in die LN, die entscheidenden Elemente in der richtigen Funktion LN und anschließend Immunantwort sind.
Die Fähigkeit, die LN Mikrovaskulatur in-vivo-Studie ist der Schlüssel zur Aufklärung, wie das Immunsystem und die Mikrovaskulatur und interagieren beeinflussen sich gegenseitig innerhalb der LN. Hier präsentieren wir eine Methode zur in-vivo-Bildgebung des inguinal Lymphknoten. Wir konzentrieren uns auf die Abbildung der Mikrovaskulatur der LN, wobei besonderes Augenmerk auf Methoden, die die Studie mit gesunden Gefäßen, die Fähigkeit zur Bildgebung von lebensfähigen Schiffe über mehrere Stunden halten und die Quantifizierung des Schiffes Größenordnung zu gewährleisten. Methoden für die Durchblutung der Mikrovaskulatur mit vasoaktiven Medikamenten sowie das Potenzial, zu verfolgen und zu quantifizieren zelluläre Verkehr werden ebenfalls vorgestellt.
Intravitalmikroskopie der Leistengegend LN erlaubt die direkte Auswertung der mikrovaskulären Funktion und Echtzeit-Schnittstelle der direkte Schnittstelle zwischen Immunzellen, die LN und die Mikrozirkulation. Diese Technik Potenzial, mit vielen immunologischen Techniken und fluoreszierende Markierung von Zellen als auch manipuliert werden, um Gefäßsystem anderer LNs Studie kombiniert werden.
Protocol
Discussion
Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten hier vorgestellten bietet die Möglichkeit, Bild Mikrovaskulatur der Lymphknoten in-vivo. So erlaubt es die Mittel der direkten Echtzeit-Beobachtung. Imaging der LN Mikrovaskulatur ist ein einzigartiger Ort, dass man die Schnittstelle zwischen der Immunantwort und das Gefäßsystem untersucht werden können. Mit dieser Vorbereitung kann konzentrieren sich speziell auf die Immunantwort, Veränderungen in den Blutgefäßen, oder Interaktion zwischen den beiden geleitet werden.
Wie bei allen experimentellen Ansätzen, hat Standard Intravitalmikroskopie sowohl Vor-und Nachteile. Standard IVM, wie die Vorbereitung hier beschrieben, kann leicht geändert werden, und wurde bereits von den Autoren gezeigt, dass Epifluoreszenzmikroskopie über die Einführung von fluoreszierenden Tracer Farbstoffe oder etikettiert Zellpopulationen ermöglichen. Obwohl Standard IVM nicht gibt die Möglichkeit der dreidimensionalen Bildgebung und Tracing, wie sie durch Zwei-Photonen-Mikroskopie oder Angiographie gegeben werden, wird die Zelle Tracking noch in zwei Dimensionen erreicht so Zell-Zell-und Zell-zu-Gefäßsystem Interaktion zu sein beobachtet und quantifiziert und in Verbindung mit in-vivo-Applikation und anschließender Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern verwendet, um Daten über Protein / Marker Ausdruck in Echtzeit geben.
Bemerkenswert ist, benötigen alternative bildgebende Verfahren einer statischen Umgebung für Bilder; Klemmung der OP-Bereich oder die Zugabe von einem Deckglas auf einem flachen Vorbereitung wird häufig benötigt werden. Dies begrenzt, wenn nicht eliminiert, die Fähigkeit zur aktiven perfuse vaskulären oder anderen Vermittlern über die Vorbereitung auf die vaskuläre Integrität und Physiologie etc. oder die Verwendung anderer Techniken wie durchgeführt Vasodilatation Experimente innerhalb der IVM Vorbereitung zu bewerten. Darüber hinaus hat Standard IVM nicht erforderlich, eine völlig ebene Vorbereitung und wird nicht durch Bewegung, wie sie durch die Atmung des Tieres erzeugt betroffen. Dies ermöglicht es Standard IVM in mehr chirurgischen Bereichen mit höherer Reproduzierbarkeit verwendet werden. Dies wird durch die Leisten-Lymphknoten-Vorbereitung hier beschriebene Beispiel. Angesichts der Größe und Form der Lymphknoten, kann das Präparat nicht flach gemacht werden ohne Verletzung des Gewebes und die Lage des Knotens führt zu erheblichen Bewegung durch tierische Atmung. Solche Fragen schwierig sein würde, durch andere Methoden zu überwinden, sind aber leicht mit der Verwendung der Standard-IVM Vorbereitung beschrieben behandelt.
Zusammenfassend kann die Herstellung oben beschrieben mit einer beliebigen Anzahl von kombiniert werden andere biochemische-, Gefäß-und / oder immunologischen Techniken wie dem Transfer von Teilmengen aktiviert oder markierten Zellen, die Induktion von Hypoxie und Überexpression von Erschöpfung der vaskulären Mediatoren. Allerdings sind zusätzliche Anwendungen abhängig von der Gesundheit der anfänglichen Vorbereitung. Daher ist es wichtig, immer testen, die Gesundheit der Gefäße wird abgebildet und ausgewertet. Wichtige Punkte zum Erreichen eines Gesundheits-Vorbereitung sind die Gewährleistung der Vorbereitung ständig mit äquilibriert PSS bei Körpertemperatur perfundiert und Minimierung des Kontakts und Stress auf den OP-Bereich während der Operation gelegt.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von der Canadian Institutes of Health Research, Canadian Foundation for Innovation, University of British Columbia Centre for Blood Research und der University of Northern BC finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich |
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Pentobarbitol |
Riferimenti
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