腹股沟淋巴结的活体显微镜

1。试剂准备在整个实验中使用的试剂应在开始手术协议前准备。请注意，所有的解决方案是采用无菌技术。 生理盐水溶液（PSS）是最好准备两部分组成：基本盐溶液和碳酸氢钠溶液。准备在这两种解决方案20X浓度和储存在4 ° C。碳酸氢钠在20X 360.0mM碳酸氢钠（84.01g/mol）和基本20X ​​浓度盐溶液94.0mM 2638.0mM氯化钠（58.44g/mol），氯化钾（74.56g/mol），40.0mM 氯化钙 •2H 2为O（147.02g/mol），并23.4mM硫酸镁4•7H 2 O（246.48g/mol）。应准备在DH 2 O和化学品的解决方案应补充一次，搅拌，直到解决方案之前加入未来的化学品准备的PSS 2L等量的碳酸氢钠和基本盐溶液稀释，稀释至1X浓度（的PSS 2L每个碳酸氢钠和基本盐溶液稀释100毫升卫生署2 置于2L容量瓶在37℃水浴中含有PSS和PSS。 1小时前平衡的解决方案，以外科手术开始，用5％的CO 2 /平衡氮气。 血管活性化学物质（如苯肾上腺素，乙酰胆碱，硝普钠）是最好的准备1M浓度在dH2O和100μL分装储存于-20 ° C 2。动物的制备确定鼠标的重量和管理的初始剂量的戊巴比妥钠腹腔注射每千克90毫克。整个过程中，鼠标不断监测麻醉通过脚趾捏和呼吸频率的仔细检查飞机。管理附加注射戊巴比妥钠20mg/kg维持麻醉平面的需要。手术的麻醉平面维持在联邦和机构法规的规定，动物护理和使用北卑诗大学（ACUC）委员会批准的协议动物保健概述。 删除从腹部和侧面/臀面积由剃须刀的头发。删除剩余的酒精棉签松散的头发，拍着用胶带面积。这是足够的，因为这样的实验过程是终端。 在仰卧位放置在一个明确的手术板鼠标和附加录音每个脚垫板鼠标板。保持体温是通过外部加热灯，并通过直肠温度计监测，以确保低温麻醉剂不会发生。 3。外科手术确保在整个手术过程中暴露的组织始终保持平衡回暖的PSS液灌流。同样重要的是永远不会与血管手术器械的利益​​接触或放置在他们用力过猛，通过操纵他们周围的脂肪组织和结缔组织的伤害船只。 将鼠标下的解剖范围。沿着腹面中线切开腹腔，并收回对鼠标的脊柱皮肤。 一旦皮肤回缩，使LN是很容易看到，针到一个透明Sylgard 184底座的皮肤。 删除的一层薄的结缔组织，覆盖该地区周围的LN 清除脂肪组织覆盖和周围的淋巴结，直到微血管床暴露。毗邻的LN的主要动脉段规定，通常由小静脉重叠。整个手术大约需要30分钟。 4。成像和血管分析一旦血管段的利息是根据解剖的范围公开，安全上编制的活体显微镜。请注意，动物仍然明确手术板，而在整个实验期间活体显微镜。体温是通过加热灯和维护，通过直肠温度计测量，在手术节所述。麻醉平面还监测整个实验过程中，如在2.1节中所述。 成立灌流和吸线。出现的PSS灌流水库的重心从饲料，成由5％CO 2平衡氮灌注水套加热水库（传阅和循环水浴加热水套），并为10ml的速度向下滴水线/分钟。应采用吸线，继续拉从筹备灌流PSS的距离。请注意，实验前吸线和水套进行彻底清洗和存储每次实验后。这将确保不育之前的下一个实验。 检查superfusing PSS的温度。调整温度循环水的浴缸和/或PSS的灌流速度，实现温度〜37 ° C整个准备工作。 允许血管与PSS的平衡至少60分钟，使用视频卡尺量化血管直径。通常，血管直径应确定在多点（例如，在40，50和60分钟），以确保船只已趋于稳定。 评估使用一个特定的平滑肌激动剂（如去氧肾上腺素，PE）和内皮细胞的特定受体激动剂（如乙酰胆碱，乙酰胆碱）的船只的健康。取决于激动剂激动剂浓度应调整，但PE和ACH船只应在评估每个浓度累积增加（10 – 5M 10 – 9M）的superfusate。每个受体激动剂的应用程序应使用PSS的船只，直到返回休息直径（一般为30分钟）一洗相分离。 可以进行以下评估血管健康，随后的血管活性药物，荧光标记，并跟踪实验细胞。 实验结束后，动物过量戊巴比妥钠。动物监测，以确保到脚趾捏和缺乏运动呼吸或心脏跳动，没有响应。在这样的时间，这是颈椎错位。 5。代表性的成果： 继平衡期的准备工作应产生清晰的图像，可以提供的腹股沟淋巴结的动脉和小静脉识别。应该有最小的脂肪细胞周围的船只，以便清楚地观察到的视频叠加计算血管内径卡尺的小动脉和小静脉的墙壁。一个成功的准备整点是动脉有丰富的血液供应，通过腔和血管张力有一个显着的程度（即动脉有能力vasoconstrict vasodilate平滑肌和内皮细胞的特定受体激动剂分别） 。 图1。腹股沟淋巴结动脉饲料喂养淋巴结平衡与生理盐水和沿端运行的主要微静脉（绿色箭头）（红色箭头）的活体显微镜图像。 图2。累计除了生理盐水灌流苯肾上腺素（PE）的浓度正常的血管活性物质的反应 10-9米至10 -5 M 。一个强大的血管收缩的存在是正常的动脉平滑肌功能目前的暗示。 图3。累计此外，从浓度生理盐水灌流乙酰胆碱（ACH）的正常血管活性反应10-9米至 10 -5 M。一个强大的血管舒张的存在是正常的动脉血管内皮功能目前的暗示。