Utilisation Mont entier<em> In situ</emHybridation> Lien vers biologie moléculaire et Organismal

1. Transformation du plasmide cible d'ADNc Partie I: Transformation du plasmide (Temps requis: 3 heures plus une nuit d'incubation) Chaud SOC bouillon nutritif dans un bain de 42 ° C de l'eau (500 pi par réaction) Décongeler les cellules compétentes sur la glace Ajouter 1 ul de plasmide à 25 uL des cellules compétentes Placez-les sur de la glace pendant 20 minutes Cellules de choc thermique dans 42 salle de bain ° C de l'eau pendant 45 secondes Placez immédiatement les cellules sur de la glace pendant 2 minutes Ajouter 500 ul de 42 ° C bouillon nutritif à chaque flacon de cellules Agiter à 37 ° C pendant 2 heures à 255 rotations par minute (rpm) Plaque 75 ul mélange de transformation sur le milieu Luria Bertani (LB) des plaques d'agar Incuber inversé à 37 ° C pendant la nuit Partie II: E. Culture coli (Temps requis: 15 minutes, plus une nuit d'incubation) Pour chaque réaction,aliquote de 3 ml de bouillon LB et 3 ul de 50 mg / ml d'ampicilline dans un tube de culture Grattez 1 colonie de bactéries de la plaque d'agar et ajouter à chaque tube de culture Agiter les tubes de culture à 37 ° C à 255 tours par minute pendant la nuit Partie III: Préparation du plasmide (Temps requis: 1,5 heures) Isoler plasmide de cultures d'une nuit en utilisant le 5 Kit Premier Mini FastPlasmid (catalogue # 2300000) Pour vérifier la présence de plasmide préparé, exécutez l'ADN élué de la trousse à raison de 1% de Tris-Acétate-EDTA (TAE) Gel coloré au bromure d'éthidium 2. In Situ DIG-ARN marqué la sonde de synthèse Partie I: La linéarisation du plasmide (Temps requis: 2,5 heures) Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: Préparé plasmide 20 ml * Restriction Enzyme </td> 2 ml Tampon ** 10 ml 10X albumine bovine sérique (BSA) 10 ml Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) Eau 58 ml 100 ml Incuber à 37 ° C pendant 2 heures * Varie avec le plasmide ** Varie avec l'enzyme de restriction Partie II: transcription (Temps requis: 3 heures) Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: Le plasmide linéaire 4 ml Tampon de transcription 10X ** 4 ml Label Mix digoxigénine 4 ml * Polymérase 2 ml RNase Inhibitor 2 ml L'eau DEPC 24 ml 40 ml Incuber à 37 ° C pendant 1 heure Ajouter 2 ul de polymerase * Incuber à 37 ° C pendant 1 heure Ajouter 2 ul de DNase Incuber à 37 ° C pendant 20 minutes * Varie avec le plasmide ** Varie en fonction de la polymérase Partie III: Précipitations (Temps requis: 5 minutes plus 2 heure à une nuit d'incubation, 1 heure à centrifuger et remettre en suspension) Ajouter 4 ul de 0,2 M EDTA Ajouter 5 ul de chlorure de lithium 4M Ajouter 150 ul d'éthanol à 100% de la glace froide Incuber à 80 ° C pendant 2 heures ou toute la nuit Centrifuger à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C, décanter le surnageant loin Séchez à granulés pendant 7 minutes Remettre en suspension dans 20 ul d'eau DEPC Incuber à37 ° C pendant 5 minutes Partie IV: Fractionnement – Effectuer seulement si la taille de la sonde est supérieure à 0,6 kb (Temps nécessaire: Varie en fonction de la taille de la sonde, généralement pas plus de 20 minutes) Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: Sonde ARN 20 ml L'eau DEPC 12 ml Bicarbonate de sodium 4 ml Carbonate de sodium 4 ml 40 ml Incuber dans un bain d'eau à 60 ° C. Baser le temps d'incubation sur l'équation: Temps (min.) = (à partir ko – souhaité ko) / (0,11 x à partir ko x souhaité ko) Moyenne taille désirée = 0,6 kb Partie V: Précipitations final (Temps requis: 5 minnutes plus 2 heure à une nuit d'incubation, 1 heure à centrifuger et remettre en suspension, 1 heure pour électrophorèse sur gel) Ajouter 40 ul d'eau DEPC Ajouter 8 ul d'acétate de sodium Ajouter 1,04 ul d'acide acétique glacial Ajouter 240 ul de glace froide éthanol à 100% Incuber à 80 ° C pendant 2 heures ou toute la nuit Centrifuger à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C, décanter le surnageant loin Séchez à granulés pendant 7 minutes Remettre en suspension dans 20 ul d'eau DEPC Vortex pour mélanger Pour vérifier la présence de ribosonde, exécutez la solution re-suspendu sur un gel coloré TAE 1% au bromure d'éthidium 3. Mont toute hybridation in situ Partie I: Fixation des embryons et la protéinase K Digestion (Temps requis: Correction heures de nuit majoré de 4 le lendemain pour le stockage, 2,5 heures de stockage à la partie II) Recueillir mise en scène embryons de poisson zèbre et le fixer à 4% parformaldéhyde (PFA) pendant une nuit à 4 ° C Laver embryons fixes en tampon phosphate salin contenant 0,1% de Tween-20 (PBST) 3 fois pendant 10 minutes chacun Pour assurer que l'exposition des embryons à des réactifs de laboratoire, les embryons manuellement dechorionate (si nécessaire) en utilisant une pince à pointe fine Déshydrater embryons par lavage dans une série graduée de 25% et 50% de methanol dans du PBST pendant une heure chaque lavage, puis stocker dans le méthanol à 100% à -20 ° C Lorsque vous êtes prêt à utiliser, réhydrater les embryons dans du PBST par un lavage à 50% (2 fois) et 25% (1 fois) méthanol dans du PBST pendant 10 minutes chacun. Enfin laver 2 fois pendant 10 minutes chacun dans du PBST 100%. Le calendrier exact n'est pas important pour PBST / méthanol lavages Embryons de blanchiment dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 10% dans du PBST, si nécessaire, pour éliminer les pigments noirs. Les embryons doivent incuber dans une solution de peroxyde d'hydrogène pendant 10-20 minutes, en fonction de l'âge de l'embryon, et le bouchon du tube de centrifugeuse doit rester ouvert afin d'éviter l'accumulation d'airpression Recueil des embryons de 50 mg / ml protéinase K diluée à 1:5000 dans du PBST pendant 3-15 minutes, en fonction de l'âge de l'embryon Re-fix embryons en PFA à 4% pendant 30 minutes, puis laver 3 fois dans du PBST pendant 5 minutes de chaque Partie II: L'hybridation des ribosondes (Temps requis: 3 heures et nuit à l'hybridation, 1,5 heure le lendemain à la partie III) Prehybridize embryons avec une solution de pré-hybridation (PHS) dans un four préchauffé à 70 ° C eaux bain pendant 2-3 heures Retirer PHS, ajouter 0,5 ml de solution d'hybridation et 1,5 uL précédemment synthétisés digoxigénine ribosondes étiquetés, incuber à 70 ° C pendant la nuit. La température peut varier de quelques degrés en fonction de la cible ribosonde Le lendemain, lavez embryons à 70 ° C dans des solutions graduées de 75%, 50% et 25% PHS en 2X solution saline de citrate de sodium (SSC) pendant 10 minutes chacun, puis laver à 0,2 X SSC pendant 30 minutes à 68 ° C <li wash> dans le tampon acide maléique (MAB) 2 fois pour 10 minutes chacune à la température ambiante Partie III: Anti-digoxigénine (DIG-α) d'incubation d'anticorps (Temps requis: 3 heures et nuit à bloquer, 2,5 heures le lendemain de la partie IV) Transfert d'embryons à une plaque à 12 puits Pré-bloc embryons dans une solution de blocage 1-2 ml pendant au moins 3 heures à température ambiante Simultanément, avant de bloquer la préparation d'anticorps par un deuxième volume de solution de blocage et de dilution de l'anticorps anti-digoxigénine 1:2000 dans cette solution Retirer pré-bloc et ajouter 1-2 ml pré-bloqué α-DIG solution, incuber une nuit à 4 ° C Le lendemain, lavez les embryons in MAB. Laissez les embryons en incubation dans du MAB pour 5 premières minutes, puis effectuez les modifications de tampon et incuber pendant deux 10 minutes, une de 30 minutes et un intervalle de 60 minutes. Le calendrier exact n'est pas nécessaire Laver 3 fois les embryons pendant 5 minutes chaque in phosphatase alcaline (AP) tampon Partie IV: La coloration et le traitement final (Temps requis: 1 heure à une nuit pour la coloration, selon la ribosonde utilisé, 4 heures à début de lavages glycérol, 6-10 heures par cycle de lavage, le glycérol peut être stockée dans de la glycérine) Ajouter 1-2 ml de solution de coloration des embryons, enveloppez-le dans du papier plaque, et vérifier la coloration à intervalles réguliers (environ toutes les 20 minutes) jusqu'à ce que la coloration est suffisante Laver embryons avec du PBST 2 fois pendant 5 minutes chacun pour arrêter la réaction de coloration Déshydrater embryons en utilisant 10 lavages minute 25% (1 heure) et 50% (2 fois) méthanol dans du PBST, puis dans le méthanol à 100%, pour enlever les taches de fond Laissez embryons à incuber dans du méthanol à 100% pendant au moins 2 heures à la température ambiante Réhydrater en utilisant PBST 10 lavages minute 50% (2 fois) et 25% (1 fois) méthanol dans du PBST, puis lavez à 100% PBST 2 fois Transfert électronique teintémbryos à une solution de glycérol à 80% dans du PBST, en utilisant une série graduée de lavages, et conserver à 4 ° C. Recettes: Plaques de gélose LB-10 gélose LB + 250 g ml d'eau distillée, autoclave, lorsqu'elles sont froides au toucher ajouter 250 ul d'ampicilline, versez 15-20 ml de solution chaude dans chaque boîte de Pétri, gélose permettent de solidifier Bouillon LB-12.5 bouillon LB + 200 g ml d'eau distillée, autoclave, laisser refroidir avant de l'utiliser 1% TAE gel d'agarose 0,4 g, 40 ml TAE 1X, 2 ul de bromure d'éthidium; charge 7 pl plasmide (plasmide de transformation de la cible d'ADNc) ou 3 et 4 ribosonde ul ul d'eau DEPC (En synthèse DIG marqué in situ d'ARN Probe) + 1 colorant de charge pL, 5 pl échelle d'ADN Préhybridation solution-50% de formamide, 5X SSC, 9.2mm acide citrique, 1% de Tween-20 Hybridation solution de pré-hybridation solution plus 500 pg / ml d'ARNt et 50 pg / ml d'héparine MAB-100 mM d'acide maléique, 150 mM NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% de Tween-20, le pH à 70.5 Blocking Solution-3 pièces MAB, 1 pièce 10% de réactif Boehringer blocage dans MAB, 1 partie de la chaleur désactivé agneau sérum Tampon AP-60 mM Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% de Tween-20 Coloration Solution-5-Bromo-4-chloro-3-indolyle (BCIP) et Nitro bleu de tétrazolium (NBT) en tampon AP 4. Les résultats représentatifs Quand elle est réalisée correctement, la réaction entre le NBT, CBPI, et la phosphatase alcaline se former un précipité violet qui doit figurer sur l'embryon de poisson zèbre comme une tache pourpre. Ribosondes doit être préalablement synthétisé à partir de l'ADNc correspondant au gène d'intérêt. Par conséquent, on peut conclure toute tache représente visualiser les zones du poisson zèbre dans lequel le gène d'intérêt a été transcrit à ce stade de développement particulier. Pour les besoins de ce cours, ribosondes ont été synthétisés à partir de aldh1a2 (anciennement raldh2; Begemannet al, 2001;. Figure 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figure 2); Deltac (Oates et al, 2005);. MyoD1 (Weinberg et al, 1996);. SHHA (Krauss et al,. 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figure 3) et myl7 (anciennement cmlc2;. Yelon et al, 1999) ADNc. La coloration a été prévu sur la ligne médiane et dans les structures anatomiques, y compris les somites, bourgeon caudal, myotome, le cerveau et le cœur. Ace/fgf8a mutants étaient censés avoir des défauts dans la plupart de ces structures. La coloration a été facilement visualisées avec un microscope standard dissection. Autres sources contiennent plus d'informations sur le dépannage et SOUHAITEZ des techniques similaires à celles décrites ici (Clark, 2003; D'Costa et al, 2009;. Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). Figure 1. A emb poisson zèbreryo 24 heures après la fécondation, ce qui a été hybridée avec ribosondes spécifiques pour aldh1a2. Le marquage spécifique peut être vu dans les yeux, rhombencéphale, pectorale nageoire bourgeon primordia, et somites. Est antérieure à la partie supérieure, postérieure est au fond. Figure 2. Un embryon de poisson zèbre à l'étape 13 somites de développement qui a été hybridé avec une sonde spécifique pour fgf8a. La coloration spécifique est vu dans le télencéphale, diencéphale dorsal, le mésencéphale-rhombencéphale limite, somites, et bourgeon caudal. Ventrale est à gauche, dorsale est à droite. La figure 3. A 22 heures après la fertilisation embryon de poisson zèbre qui a été hybridé avec une sonde ribonucléique spécifique pour pax2a, un marqueur solide utile pour la visualisation du système nerveux. Le marquage spécifique peut être seen dans la fissure choroïde, le mésencéphale-rhombencéphale limite, vésicule otique, et les neurones de la moelle épinière. Vue dorsale d'avant à gauche.