Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia
Summary
Neste vídeo, demonstramos a visualização da translocação da PKC em células vivas usando PKCs fluorescente etiquetado.
Abstract
Proteína quinase Cs (PKCs) são serina treonina quinases que desempenham um papel central na regulação de uma ampla variedade de processos celulares como crescimento celular e aprendizagem e memória. Há quatro famílias conhecidas de isoformas da PKC em vertebrados: PKCs clássica (α, βI, βII e γ), tipo romance que PKCs (ε e η), novo tipo II PKCs (δ e θ), e PKCs atípicos (ζ e ι ). O PKCs clássica são ativadas por Ca 2 + e diacylclycerol (DAG), enquanto o PKCs romance são ativadas por DAG, mas são Ca 2 +-independente. O PKCs atípicos são ativadas por Ca 2 + nem nem DAG. Em Aplysia californica, o nosso sistema modelo para estudar a formação da memória, há três isoformas específicas do sistema nervoso PKC um de cada classe principal, ou seja, o convencional PKC Apl I, o novo tipo I PKC Apl II ea PKC atípica Apl III. PKCs são lipídios cinases ativadas e, portanto, a ativação de PKCs clássica e romance em resposta a sinais extracelulares tem sido freqüentemente correlacionada com a translocação da PKC do citoplasma para a membrana plasmática. Portanto, visualizando translocação da PKC em tempo real em células vivas tornou-se uma ferramenta valiosa para a elucidação das vias de transdução de sinal que levam à ativação da PKC. Por exemplo, esta técnica permitiu-nos estabelecer que diferentes isoformas da PKC translocate sob diferentes condições de mediar tipos distintos de plasticidade sináptica e que a serotonina ativação (5HT) da PKC Apl II requer a produção de ambos os DAG e ácido fosfatídico (PA) para translocação 02/01. Importante, a capacidade de visualizar o mesmo neurônio repetidamente nos tem permitido, por exemplo, para medir a dessensibilização da resposta PKC no requintado detalhe 3. Neste vídeo, demonstramos cada etapa de preparação de culturas de células Sf9, culturas de neurônios sensoriais Aplysia foram descritas em outro artigo de vídeo 4, expressando PKCs fluorescente etiquetado em Sf9 células e nos neurônios sensoriais Aplysia e live-imaging de translocação da PKC em resposta a ativadores diferentes, utilizando microscopia de varredura a laser.
Protocol
Discussion
Nós descrevemos uma técnica para translocação imagem de PKCs fluorescente etiquetado em tempo real em Sf9 células e nos neurônios sensoriais Aplysia. Sf9 células fornecer um sistema simples de translocação imagem PKC desde cultura e transfecting deles é bem simples. Em contraste, a microinjeção de neurônios sensoriais Aplysia leva algum tempo para dominar, até alguns meses. Dificuldades relacionados a essa técnica incluem o entupimento do eletrodo. Filtragem da solução de injeção e c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Grant para Wayne S. Sossin. Carole A. Farah é o destinatário de uma bolsa de pós-doutorado do Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e um Conrad Harrington comunhão. Os autores gostariam de agradecer Joanna Bougie, Margaret Hastings e Margaret Labban para ajudar com a gravação de vídeo e Piscina Madeline Richmond para ajudar com a visão geral gráfica.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
Riferimenti
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
