アコースティック膜の微粒子技術を使用してカスタムチャイニーズハムスター卵巣-宿主細胞タンパク質のアッセイを開発する

1。微粒子の調製ビオチンNHS化学を使用してラベルの抗体ビオチン化の程度の決定ビオチン化抗体とコンジュゲートストレプトアビジンビーズ 1〜2分間ボルテックスして、元のバイアルでビーズを再懸濁しますマイクロ遠心チューブに分注しビーズの目的のボリュームを PBSTでビーズを3回洗浄。 2分間磁石でビーズを含むチューブを置きます磁石上にチューブで吸引して上清を取り除きます。ビーズを妨害しないように注意してください磁石からチューブを外し、1 mLのPBSTを追加ビーズを再懸濁するために20秒間ボルテックスキャップからビーズを除去するために5秒間遠心分離します。 さらに2回2.3.1-2.3.5を繰り返します第三洗浄は、磁石にチューブを配置し、PBSTを吸引除去した後ビーズにビオチン化抗体を追加し、再懸濁必要な場合は、PBSで300μLにビオチン化抗体の量を持ち出す。抗体の量は任意のPBSを追加しない既に超えて300μLである場合ボルテックスシェーカーまたはチューブローテーターで室温で30分間ビーズ/抗体サスペンションをインキュベートステップ3のようにPBSTで3回洗浄する。 ビオチン化BSAでビーズをブロックする第三洗浄には10μg/ mgのビオチン化BSAを追加した後、PBS必要に応じて300μLに音量を調節し、30分間撹拌しながらインキュベートステップ3のようにPBSTで3回洗浄する PBS/0.05％のBSAの100μLでビーズを再懸濁します。アジ化ナトリウムは、長期保管のために追加することができます。 標準NHSフルオレセインのプロトコルを使用して、検出抗体をfluoresceinate Fluorescinationの程度を決定 2。 HCP – 開発ワーキング溶液の調製法フルオレセイン標識抗体（FL – AB）：ほとんどのCHO – HCPアッセイは、400 ng / mLの最終濃度でFL – Abを使用してください。 FL – ABは、ワーキング溶液の濃度が1.6μg/ mLとなるため、最終アッセイ体積の¼として追加されます。 BioScaleビーズ/ぜい肉希釈液でぜい肉の株式を希釈することにより、この溶液を調製します。 ビーズ：ほとんどのCHO – HCPアッセイは、2 × 10 5ビーズ/ mlの最終濃度でビーズを使用してください。ビーズ試薬は、最終アッセイ体積の¼を構成しているのでワーキング溶液の濃度は、5ビーズ/ mLの8 × 10です。 BioScaleビーズ/ぜい肉希釈液でビーズ株式を希釈することにより、この溶液を調製します。渦ビーズ株式はよく確認するために、すべてのビーズは、アリコートを除去する前に、懸濁液です。 ランニングバッファー：ランニングバッファーの組成は、アッセイを開発するために使用される抗体のために最適化されなければならないかもしれない、しかし、いくつかのCHO – HCPアッセイは、10mMのHEPES緩衝液を使用して開発された、1％のTween、pH7.5の。 BioScaleは使用前に1％の濃度にバッファに追加されるランニングバッファー（開発キットに付属）のための添加剤を開発しました。 BioScaleサンプル希釈液で校正し、試料を希釈する。 3。 ViBEプロダクトシステムのセットアップグラスバレーのワークステーションの電源をONにシステムの供給と廃棄物を接続するプライムシステムグラスバレーカートリッジを挿入チューブを配線します。 "サンプルの設定"というラベルシートに記入することによってアッセイのテンプレートを準備します。 BioScaleは、それぞれのグラスバレーのワークステーションのアッセイ用のアッセイのテンプレートを持っている機能を提供します。これにより、ユーザーは実験の完全な記録を保持する別のアッセイのためのテンプレートの"注意事項"シート内の特定のノートを編集して保存することができます。 初期アッセイのテンプレートは、設定する："サンプルの設定"シートのアッセイの標準の濃度範囲の表（左上隅）を記入することから始めます。 次に、試薬の量を転送する場合どの程度、インキュベートする必要があるどのくらいのサンプルがグラスバレーのワークステーションを指示する（単純な列は、一つの試薬の追加と2つの試薬の追加セットアップをセットアップを読む）規格の右側のテーブルに追加情報を入力してください、サンプルの蓄積がする必要があるどのくらいの時間、およびセンサーの調整とプローブとカートリッジの汚染除去が必要かどうか、などプレートのレイアウトを記入してください。 プレートに試料/試薬をロードします。雰囲気は試薬のプレートのために必要なボリュームを提供します。サンプル量が異なりますが、120μLの全アッセイ体積の半分でよい出発点であることができる。 プレートカバーを適用します。ワークステーションのデッキの上にプレートをロードします。 ウィザードを起動アッセイを実行、ウィザードの指示に従って移動し、アッセイを開始します。 4。代表的な結果 図1：AMMPサンドイッチ免疫測定法 </p> グラスバレーのワークステーションで、AMMPアッセイは、抗原の濃度を測定する。信号はビーズ – 抗原 – ハプテン抗体がハプテン/抗ハプテン相互作用を介してセンサーに結合するときに測定されます。再生には、免疫複合体を除去することによって最初の状態に戻ってセンサーをもたらします。 図2：CHO – HCP AMMPアッセイの検量線 上記の図2は、CHO HCP AMMPアッセイの検量線の例です。分析は高精度と再現性を持つ原子炉を含む精製ストリーム全体からのサンプルで実行することができます。 図3：プロテインAMMPアッセイの検量線 図3は、VIBE残留タンパク質アッセイキットを使用して実行によりタンパクの残渣AMMPアッセイのための検量線です。同キットは、30分間の潜伏期間を持つ高速なアッセイのための、またはより高感度な結果のために使用され、ユーザーは通常、同等のELISAのより良いが、どちらも精度や正確さを失うことなく、長い潜伏期間を持つ広いダイナミックレンジ、することができます"手 図4：製品タイターAMMPアッセイ グラスバレーのワークステーションは、結果が図4に示すように、製品の力価検定にも使用できます。他のAMMPアッセイとは異なる方法で実行される、このアッセイは、単純な希釈、またはビーズよりサンプル処理が他の必要としない、と定量は、生存率の広い範囲にわたって1000万人以上の細胞を含む"無スピン"のサンプルで確認されています。 図5：GST – Gadd34バイオマーカーアッセイのためのAMMPアッセイ標準曲線 図5に示すには、グラスバレーバイオアナライザ（パネルA）または組換えGST – Gadd34を使用してAlphaScreenテクノロジーによって得られた信号の標準曲線である。グラスバレーのプラットフォーム上での結果はほぼ同じ抗体を使用して、より敏感なログでした。 AMMPはまだ少数の大きい粒子の液相捕捉および検出複合体形成から、まだ利益の測定を利用しています。 図6：腫瘍サンプル中のGST – Gadd34用AMMPアッセイ標準曲線 図6では、CWR22異種移植片からGadd34の誘導は、グラスバレーバイオアナライザ（パネルA）またはAlphaScreen（パネルB）のいずれかの方法で分析したボロネートプロテアソーム阻害剤の存在下または非存在下で試験された。 ViBEプロダクトプラットフォームはAlphaScreenシグナルはタンパク質の増加μgのでクエンチしたのに対し、in vivoでの腫瘍異種移植片での敏感な、再現性のある結果を生み出すことができた。 この例では、非常に複雑なサンプル中のAMMP技術の力を示しています。チップの近くに磁石の高感度な検出チップや高効率のために、磁性微粒子の低い数字は、効率的かつ再現性よく溶解した携帯電話（溶解試薬を含む）と血液の残骸の複雑さの中に低濃度の目標のために清掃できます。