Het ontwikkelen van aangepaste Chinese hamster ovarium-host Cell Protein Testen met behulp van akoestisch vlies micropartikel Technology

1. Microdeeltje Voorbereiding Label antilichamen met behulp van Biotine NHS Chemie Bepaling van de Graad van biotinylatie Conjugaat Streptavidine Kralen met gebiotinyleerd antilichaam Resuspendeer de kralen in de originele flacon door vortexen gedurende 1-2 minuten Aliquot het gewenste volume van kralen in een microcentrifugebuis Was de kralen 3 keer met PBST: Plaats de buis met de kralen op de magneet gedurende 2 minuten Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie met de buis op de magneet. Wees voorzichtig dat u de kralen te verstoren Haal de buis van de magneet en voeg 1 ml PBST Vortex gedurende 20 seconden om de kralen resuspenderen Centrifugeer gedurende 5 seconden ingedrukt om de parels uit de dop Herhaal dit twee keer 2.3.1-2.3.5 meer Na de derde plaats was de buis op de magneet en zuig de PBST Voeg gebiotinyleerd antilichaam aan de kralen en resuspenderen Indien nodig brengt het volume van de gebiotinyleerde antilichaam tot 300 pi met PBS. Als het antilichaam volume is al meer dan 300 pi voeg geen PBS Incubeer de kraal / antilichaam suspensie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de vortex shaker of buis rotator Was drie keer met PBST zoals in stap 3. Blok kralen met gebiotinyleerd BSA Na de derde wasbeurt toe te voegen 10 ug / mg gebiotinyleerd BSA, past u het volume op 300 ul met PBS, indien nodig, en incubeer onder schudden gedurende 30 minuten Was drie keer met PBST zoals in stap 3 Resuspendeer de kralen in 100 ul van PBS/0.05% BSA. Natriumazide kan worden toegevoegd voor de lange termijn opslag Met behulp van standaard NHS Fluoresceïne protocollen, fluoresceinate de detector antilichaam Bepalen de mate van Fluorescination 2. HCP – Ontwikkeling Bereid te werken oplossingen: Fluoresceïne gelabeld antilichaam (Fl-Ab): De meeste CHO-HCP assays gebruiken Fl-Ab bij een uiteindelijke concentratie van 400 ng / mL. De FL-Ab wordt toegevoegd als ¼ van de laatste test volume, dus de concentratie van de werkende oplossing is 1,6 microgram / ml. Bereid deze oplossing door verdunnen flab voorraad met BioScale Bead / flab Diluent. Kralen: De meeste CHO-HCP assays gebruiken kralen bij een uiteindelijke concentratie van 2×10 5 kralen / ml. De kraal reagens vormt ¼ van de uiteindelijke test volume, dus de concentratie van de werkende oplossing is 8×10 5 kralen / ml. Bereid deze oplossing door verdunnen kraal voorraad met BioScale Bead / flab Diluent. Vortex de kraal voorraad goed om ervoor te zorgen dat alle parels worden in suspensie voorafgaand aan het verwijderen van een aliquot deel. Running Buffer: De samenstelling van het lopende buffer kan worden geoptimaliseerd voor de antilichamen gebruikt worden om de test te ontwikkelen, maar een aantal CHO-HCP testen zijn ontwikkeld met behulp van 10 mM HEPES buffer, 1% Tween, pH 7,5. BioScale heeft ontwikkeld, een additief voor de lopende buffer (meegeleverd met de development kit), die wordt toegevoegd aan de buffer tot een concentratie van 1% voor gebruik. Verdunnen kalibrators en monsters met BioScale Sample Diluent. 3. ViBE System Set Up Schakel de ViBE Workstation op Sluit het systeem leveren en afval Prime van het systeem Plaats een ViBE cartridge Route van de buizen Bereid test template door het invullen van het blad met het label "Sample Setup". BioScale biedt de mogelijkheid om een ​​test template voor iedere ViBE Workstation test. Hierdoor kan de gebruiker te bewerken en specifieke notities op te slaan in de "Notes" vel van de sjabloon voor de verschillende assays het bijhouden van een volledig verslag van het experiment. De eerste test template set up: Begin met het invullen van de tabel (linker bovenhoek) van de concentratie bereik van de normen in de test in de "Sample Setup" sheet. Volgende, aanvullende informatie in de tabel in te voeren om het recht van de normen (Simple Column Lees Configuratie, Een reagens toevoegen en Two Reagent Add setups) naar de Vibe Workstation hoe lang monsters moet broeden instrueren, hoeveel volume reagens is over te dragen , hoe lang het monster accumulatie dient te zijn, en of de sensor conditionering en ontsmetting van de sondes en de cartridge nodig zijn, enz. Vul de plaat lay-out. Belasting monster / reagentia in platen. De ViBE zal de vereiste volumes voor het reagens plaat. Monstervolume kan variëren, maar in de helft van een totaal volume van de test 120 uL is een goed startpunt. Van toepassing zijn plaat dekt. Laad de borden op werkstation dek. Voer de test start up wizard, ga door wizard en start test. 4. Representatieve resultaten Figuur 1: AMMP Sandwich Immunoassay </p> Op een ViBE Workstation, een AMMP test meet antigeen concentratie. Het signaal wordt gemeten wanneer de kraal-antigeen-hapteen antilichaam bindt aan de sensor door de hapteen / anti-hapteen interactie. Regeneratie brengt de sensor terug naar het begin staat door het verwijderen van de immune complexen. Figuur 2: CHO-HCP AMMP Assay kalibratiecurve Figuur 2 hierboven is een voorbeeld van een CHO HCP AMMP Assay kalibratiecurve. Analyse kan worden uitgevoerd in monsters uit de hele zuivering beek met inbegrip van de reactor met hoge precisie en reproduceerbaarheid. Figuur 3: Proteïne A AMMP Assay kalibratiecurve Figuur 3 is een calibratie curve voor een resterende Proteïne A AMMP Test, uitgevoerd met een VIBE Resterende Proteïne A Assay Kit. Dezelfde kit kan gebruikt worden voor een snellere test met een 30 minuten incubatietijd, of voor meer gevoelige resultaten en een breder dynamisch bereik met een langere incubatieperiode zonder verlies van precisie of de nauwkeurigheid, die beide zijn meestal beter is dan vergelijkbare ELISA's in van gebruikers handen Figuur 4: Product Titer AMMP Assay De ViBE Workstation kan ook worden gebruikt voor een product Titer test, de resultaten weergegeven in figuur 4. Anders uitgevoerd dan andere AMMP Testen, is deze test niet nodig steekproef andere behandeling dan eenvoudige verdunning, of kralen, en kwantificering is geverifieerd in "geen spin" monsters met meer dan 10 miljoen cellen over een breed scala van de levensvatbaarheid. Figuur 5: AMMP Assay standaardcurve voor GST-Gadd34 biomarker analyse Weergegeven in figuur 5 is een standaard curve van het signaal verkregen door de ViBE BioAnalyzer (Panel A) of met behulp van recombinant-technologie AlphaScreen GST-Gadd34. Resultaten op de ViBE platform waren ongeveer een log gevoeliger met dezelfde antilichamen. AMMP maakt gebruik van de meting van de minder grotere deeltjes geniet nog steeds uit de oplossing fase vast te leggen en detectie complex vorming. Figuur 6: AMMP Assay standaardcurve voor GST-Gadd34 in tumormonster In figuur 6, was de inductie van Gadd34 van CWR22 xenotransplantaties getest in de aanwezigheid of afwezigheid van een boronate proteasoom inhibitor zoals geanalyseerd door ofwel de ViBE BioAnalyzer (Panel A) of AlphaScreen (Panel B). De ViBE platform was in staat om gevoelige, reproduceerbare resultaten te produceren in de in vivo tumor xenotransplantaten terwijl het AlphaScreen signaal werd geblust met een verhoogde ug van eiwitten. Dit voorbeeld toont de kracht van AMMP technologie in de zeer complexe monsters. Vanwege de gevoelige detectie-chip en een hoog rendement van de magneet in de buurt van de chips, kan lage aantallen van magnetische microdeeltjes efficiënt en reproduceerbaar scharrelen voor de lage abundantie doel te midden van de complexiteit van de gelyseerde cellulaire (inclusief lysis reagentia) en bloed puin.