Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

1. Nella formazione di biofilm in vitro Colonie batteriche (che sono state coltivate su agar appropriato durante la notte), sono stati sospesi nei media e la OD 490 è stato rettificato a 0,65 La sospensione batterica risultante è stato poi diluito 1:6 (1 ml di sospensione batterica + 5 ml preriscaldata media) e incubate a 37 ° C con 5% di CO 2 per circa 3 ore per raggiungere la metà del log fase. Diluire il mid-log 1:2500 sospensione di crescita con pre-riscaldato media e 200 ul luogo di diluizione in ciascun pozzetto di una 8-scivolo e da camera. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Dopo circa 16 ore, media aspirato da un angolo di ogni camera e aggiungere 200 microlitri fresco, pre-riscaldato a medio – lungo dispensare muro di camera in modo da non creare forze di taglio all'interno della camera che potrebbe disturbare il biofilm. Se incubazione più lungo di 24 ore, il cambiamento medio ogni 12 ore o secondo necessità per mantenere la vitalità dei batteri. 2. Visualizzazione dei biofilm Aspirare il terreno da ogni camera, come sopra descritto, e lavare biofilm residente due volte delicatamente con soluzione salina sterile. Aggiungere 200 ml di BacLight Live / Dead macchia (3 microlitri componente A 3 componente B + microlitri per mL di soluzione salina) per ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Proteggere la cultura dalla luce da questo punto in avanti. Aspirare la macchia e lavare due volte delicatamente con soluzione salina sterile come prima. Aggiungere 200 ml di formalina neutra tamponata ad ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per risolvere campione. Rimuovere fissativo e smaltire in conformità alle direttive istituzionali. Lavare due volte con soluzione salina e smaltimento dei liquidi di lavaggio contenenti formalina come sopra. Rimuovere i pozzi di plastica dalla diapositiva, aggiungere abbastanza salina in ogni pozzetto in modo che quando un coprioggetto è posto sulla guarnizione, non siano presenti bolle d'aria. Coprioggetto e sigillare i bordi del coprioggetto con mezzo di montaggio. Smalto per le unghie può essere utilizzato per sigillare le diapositive tuttavia le diapositive non sarà permanente. Lasciare che il sigillante ad asciugare per circa 1 ora prima di analizzare tramite microscopia. 3. Risultati Figura 1. Rappresentante immagini 3D composito di un biofilm formati in una 8-scivolo e da camera. I batteri sono stati etichettati con Live / Dead macchia batteri in cui vivono i batteri fluorescenti verdi e morto fluorescenza rossa. (A) immagine composita di biofilm intera che mostra l'architettura diversi con torri e canali d'acqua. (B) biofilm Stessa (A), ora visto in sezione trasversale.