에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 Entamoeba histolytica</em

1. Entamoeba histolytica에 FCU 부정적 선택 시스템 벡터 제어 라인 (HM1 / pKT3M) 및 실험 라인 (HM1/pKT3M-FCU1)은 이전에 설명한 기법 1,2에 의해 생성되었습니다. 종자는 T – 25 flasks에 재고 튜브에서 연구하에 라인 TYI – S – 33 3 중간 적절한 항생제 (12 μg / ML G418)을 추가하여 선택을 유지합니다. flasks, 37에서 성장 16~18시간 후 70-80% 합류해야 ° C. 따뜻한 TYI – S – 33 중간에 5 Fluorocytosine (5 – FC, 시그마)의 새로운 50mM 주식 솔루션을 준비합니다. 와동이 엄격하게 몇 분 동안 완전히 5 FC를 해산합니다. 필터 – 필터 소독 0.22 μm의를 통해 전달하여 주식 솔루션을. 3~5분 위해 얼음에 flasks를 삽입하고 실온에서 5 분 200xg에 centrifuging하여 세포를 수집하여 수확 trophozoites. 신선한 TYI 매체에서 펠렛을 Resuspend하고 세포를 계산합니다. 전형적인 실험 설계 1 ML의 최종 볼륨에 48 잘 접시 잘 당 0.5 X 10 4 세포를 사용하며, 각 시험 조건에 대한 세중의 반복. 또한, 형광 측정을 촉진하기 위하여, 별도의 접시는 시점마다 각 변형에 사용됩니다. 각 시험 5 – FC 농도, 세중의에 대해 잘 당 종자 0.5 X 10 4 세포. TYI 매체에서 항생제 선택 압력을 유지합니다. 지금 5 – FC 주식 솔루션과 각 잘하는 trophozoites의 필요한 금액을 추가합니다. 37 무산소 가방에 접시를 품어 ° C. 2. 선택 효율성의 결정 2 MG / DMSO에 셀 추적 녹색 CMFDA (Invitrogen)의 ML 주식 솔루션을 준비합니다. 작업 솔루션 주식​​ 혈청 무료 TYI 매체 1000 배 희석하기 위해. trophozoite 문화 접시에서 완전히 매체를 제거하고 150 μL 혈청 무료 TYI 포함 CMFDA로 바꿉니다. 37 배양을 계속 ° C 1 시간을 위해. 우물에서 염료 솔루션을 제거하고 Spectramax M2 microplate의 spectrofluorometer에서 접시를 참조하십시오. 여기 파장은 492 nm의에서 설정하고 형광 방출 517 NM에서 읽을 수 있습니다. 테스트 transfectants 대 제어 세포에 대한 형광 값을 비교합니다. 각 시간 간격에 접시를 읽고 계속합니다. 각 플레이트에 적절한 양의 (TYI 전용)과 부정 (25 μg / ML hygromycin) 제어 우물을 사용합니다. 3. 대표 결과 E. histolytica의 transfectants는 코돈 최적화 재조합 FCU1 (그림 1)의 강력한 표현을 보여주었다.이 프로토콜은 E.의 선택 제거에서 결과가 제대로 따라하면 0.5 MM 5 fluorocytosine의 존재에 FCU1을 표현 histolytica 세포. 제어 세포는 반면 5 – FC 5 MM의 농도에서 정상적으로 자라서 72 96 시간 사이의 합류에 도달 계속 (그림 2 – A). 치료 우물이 현미경으로 볼 때 48 시간에 FCU1지고 세포가 완전히 lysed 있습니다. 샘플 다수 (그림 2 – B)를 포함하는 양적 연구에서 사용되는 중요한 염료 CMFDA, 물들일 때 이들은 또한 형광 감소 보여줍니다. FCU1/5-FC 시스템 E.위한 효과적이고 강력한 부정적인 선택 도구 histolytica은 trophozoites. 그림 1. E. 생성 부정적인 선택 마커를 표현 histolytica HM1 transfectants (A) 재조합 단백질 FCU1는 안티 – C Myc 항체 (상단 패널)을 사용하여 서양 얼룩을 발견했다. 예상했던대로, 42kDa 밴드는 아니지만 혼자 벡터 제어 transfectants의 FCU의 transfectants에서 총 lysate에서 (화살표로 표시) 감지 수 있습니다. 하단 패널은 같은 얼룩이 로딩 제어로 안티 굴지 항체와 탐지 보여줍니다. (B) 정량 실시간 PCR의 결과 lgl4 제어하는 표준 FCU1 특정 mRNA의 표현을 보여주는. E. 그림 2.에서는 체외 마약 감도 부정적인 선택 마커를 표현 histolytica의 transfectants (A) 제어 transfectants 및 (b) FCU1 표현 transfectants 48 – 잘 판에 교양의 생존 곡선. 세포의 증가 농도의 존재에 재배되었던 prodrug – 5 – fluorocytosine, X – 축에 표시된로 세포 생존을 각 시간 간격으로 CMFDA의 얼룩에 의해 계량했다. Y – 축 단위 형광을 나타내고 살아있는 세포 인구의 직접적인 반영이다. FCU1 표현 transfectants가 컨트롤에 비해 0.5mM prodrug 농도에 큰 감도를 보여주는 점에 유의하십시오. 대한 세포는 COM 이러한 우물에 120h 시점에서 관찰되지 않았습니다현미경 해당 컨트롤 우물 (데이터가 표시되지 않음)에서 본 합류 성장 앞에 서. Hygro는 대조군으로 사용 25μg / ML hygromycin를 나타냅니다.