Développement d'un marqueur sélectionnable négatif pour les Entamoeba histolytica</em

1. Système FCU sélection négative dans Entamoeba histolytica La ligne de la lutte antivectorielle (HM1 / pKT3M) et la ligne expérimentale (HM1/pKT3M-FCU1) ont été générés par 1,2 les techniques décrites précédemment. Graine les lignes à l'étude à partir des tubes d'actions dans T-25 flacons et conserver la sélection par l'ajout des antibiotiques appropriés (12 pg / ml de G418) dans TYI-S-33 3 moyen. Les flacons doivent être 70-80% confluentes après 16-18 heures de croissance à 37 ° C. Préparer une solution stock de frais de 50mm de la 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) dans chaude TYI-S-33 à moyen terme. Vortex rigoureuse pendant plusieurs minutes à se dissoudre complètement la 5-FC. Filtre-stériliser la solution stock en le passant à travers un filtre de 0,22 um. Trophozoïtes récolte en plaçant les flacons sur la glace pendant 3-5 minutes et recueillir les cellules par centrifugation à 200xg pendant 5 minutes à température ambiante. Reprendre le culot dans TYI milieu frais et compter les cellules. Conception d'une expérience typique utilise 0,5 x 10 4 cellules par puits d'une plaque de 48 puits dans un volume final de 1 ml, et répète trois exemplaires pour chaque condition d'essai. En outre, pour faciliter les mesures fluorescente, une plaque séparée est utilisée pour chaque souche par point dans le temps. Graine de 0,5 x 10 4 cellules par puits pour chaque test de concentration de 5-FC, en trois exemplaires. Maintenir la pression de sélection antibiotique dans le milieu TYI. Maintenant, ajoutez la quantité requise de 5-FC solution stock et des trophozoïtes à chaque puits. Incuber les plaques dans un sac anaérobie à 37 ° C. 2. Détermination de l'efficacité de sélection Préparer 2 mg / ml solution stock de Cell Tracker CMFDA vert (Invitrogen) dans le DMSO. Pour rendre la solution de travail diluer le stock de 1000 fois dans un milieu sans sérum TYI. Retirez le support complètement de plaques de culture trophozoïte et la remplacer par 150 ul sans sérum contenant CMFDA TYI. Continuer d'incubation à 37 ° C pendant 1 heure. Retirer la solution de colorant à partir de puits et de lire la plaque dans le spectrofluorimètre microplaques Spectramax M2. La longueur d'onde d'excitation doit être réglé à 492 nm et l'émission de fluorescence lue à 517 nm. Comparez les valeurs de fluorescence pour les cellules de contrôle par rapport au test de transfectants. Continuer la lecture des plaques à chaque intervalle de temps. Utilisez positifs appropriés (TYI seulement) et négatifs (25 ug / ml d'hygromycine) puits de contrôle dans chaque assiette. 3. Les résultats représentatifs Le E. transfectants histolytica a montré une expression robuste de codon FCU1 recombinante optimisée (figure 1). Lorsque ce protocole est suivi correctement il en résulte l'élimination sélective des E. cellules exprimant FCU1 histolytica en présence de 0,5 mM de 5-fluorocytosine. Cellules de contrôle, en revanche continuer à croître normalement à un maximum de 5 mM de concentration de 5-FC et atteindre la confluence entre 72 et 96 heures (figure 2-a). Les cellules porteuses FCU1 à 48 heures sont complètement lysées lorsque le puits traités sont considérés sous un microscope. Ces montrent également une diminution de fluorescence lorsqu'elles sont colorées avec le colorant vital CMFDA, qui est utilisé dans les études quantitatives impliquant grand nombre d'échantillons (figure 2-b). Le système FCU1/5-FC est un outil de sélection efficace et puissant négatifs pour E. histolytica trophozoïtes. Figure 1. Génération de E. histolytica HM1 transfectants exprimant marqueur de sélection négative (A) FCU1 protéine recombinante a été détecté sur un western blot à l'aide d'anticorps anti-c Myc (panneau supérieur). Comme prévu, une bande 42kDa a pu être détecté (indiqué par une flèche) dans le lysat total de la transfectants FCU, mais pas dans le vecteur seul transfectants contrôle. Le panneau du bas montre la même blot sondé avec l'anticorps anti-actine comme contrôle du chargement. (B) Résultats de la PCR en temps réel quantitative montrant l'expression des ARNm spécifiques FCU1 normalisée à lgl4 contrôle. Figure 2. Sensibilité aux médicaments in vitro de E. transfectants exprimant histolytica marqueur de sélection négative Les courbes de survie des transfectants de contrôle (a) et (b) des transfectants exprimant FCU1 cultivées dans 48 puits assiette. Les cellules ont été cultivées en présence de concentrations croissantes de la prodrogue-5-fluorocytosine, la survie cellulaire a été quantifiée par une coloration CMFDA à chaque intervalle de temps que notée sur le X-axe. L'axe Y représente les unités de fluorescence et est le reflet direct de la population de cellules survivantes. S'il vous plaît noter que les transfectants exprimant FCU1 a montré une sensibilité significative à la concentration 0,5 mM prodrogue par rapport au témoin. Pas de cellules ont été observées au point dans le temps 120h dans ces puits comme comcomparé à la croissance confluente vu dans le puits de contrôle correspondants sous le microscope (données non présentées). Hygro représente 25μg / ml d'hygromycine utilisé comme contrôle négatif.