Labeling F-Aktin Barbed Endet mit Rhodamin-Aktin in permeabilisierten Neuronale Growth Cones
Summary
Eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von F-Aktin Stacheldraht endet in neuronale Wachstum Kegel beschrieben. Nach Kultivierung Neuronen auf Deckgläschen werden die Zellen mit einer Saponin-haltigen Lösung permeabilisiert. Dann enthält eine kurze Inkubation mit dem Saponin-Puffer mit Rhodamin-Aktin fluoreszierende Aktin auf freien Aktin Stacheldraht endet.
Abstract
Die beweglichen Spitzen der wachsenden Axone genannt Wachstum Kegel. Wachstum Kegel führen Navigation Axone durch die Entwicklung von Geweben durch die Interaktion mit lokal ausgedrückt molekulare Orientierung Hinweise, dass das Wachstum Kegel-Rezeptoren binden und regulieren die Dynamik und die Organisation des Zytoskeletts Wachstum Kegel 3-6. Das Hauptziel dieser Navigations-Signale ist das Aktin-Filament-Geflecht, dass das Wachstum Kegel Peripherie und treibt Wachstum Kegel Motilität durch kontinuierliche Aktin-Polymerisation und dynamischen Umbau 7 füllt. Positive oder attraktive Führung Signale induzieren Wachstum Kegel drehen durch Stimulierung Aktin-Filament (F-Aktin) Polymerisation in der Region das Wachstum Kegel Peripherie, die näher an der Quelle der Lockstoff Cue. Das Aktin-Polymerisation Laufwerke lokales Wachstum Kegel Vorsprung, die Haftung der führenden Rand und axonale Elongation in Richtung der Lockstoff.
Aktin-Filament-Polymerisation hängt von der Verfügbarkeit ausreichender Aktin-Monomer und auf Polymerisationskeime oder Aktin-Filament-Stacheldraht endet für die Zugabe von Monomer. Aktin Monomer ist reichlich vorhanden in chick Netzhaut-und Spinalganglien (DRG) Wachstum Kegel. Folglich steigt der Polymerisation schnell, wenn der freie F-Aktin Stacheldraht endet für Monomerzugabe werden. Dies geschieht in chick DRG und Retina Wachstum Kegel über die lokale Aktivierung der F-Aktin-Abtrennung Aktin Depolymerisation Faktor (ADF / Cofilin) in das Wachstum Kegel Region näher an einem Lockstoff 8-10. Diese erhöhte ADF / Cofilin Aktivität trennt Aktinfilamente zu neuen F-Aktin Stacheldraht endet für die Polymerisation zu erzeugen. Die folgende Methode demonstriert diesen Mechanismus. Gesamtgehalt an F-Aktin ist durch Färbung mit Fluoreszenz-Phalloidin. F-Aktin Stacheldraht endet visualisiert werden durch den Einbau von Rhodamin-Aktin im Wachstum Kegel, die mit dem Verfahren in den folgenden, die aus früheren Studien anderer bewegliche Zellen 11, 12 angepasst ist beschrieben permeabilisiert werden. Wenn Rhodamin-Aktin bei einer Konzentration oberhalb der kritischen Konzentration für die Aktin-Monomer neben Stacheldraht endet hinzugefügt wird, baut Rhodamin-Aktin auf freie Stacheldraht endet. Wenn die attraktive Cue in einen Farbverlauf, wie wird aus einer Mikropipette positioniert, um eine Seite eines Wachstums Kegel freigegeben präsentiert wird, wird die Aufnahme von Rhodamin-Aktin auf F-Aktin Stacheldraht endet größer das Wachstum Kegel Seite in Richtung der Mikropipette 10 .
Growth Zapfen sind klein und zart Zellstrukturen. Die Verfahren der Permeabilisierung, Rhodamin-Aktin Einbau, Fixierung und Fluoreszenz-Visualisierung sind alle sorgfältig gemacht und kann auf der Bühne einem inversen Mikroskop durchgeführt werden. Diese Methoden können auf das Studium vor Ort Aktin-Polymerisation in wandernde Neuronen, andere primäre Gewebe oder Zelllinien werden.
Protocol
Discussion
Die hier vorgestellten Methoden erlauben zeitliche und räumliche Auflösung der zellulären Komponenten, die in der dynamischen Umbau des Aktin-Zytoskeletts bei den führenden Marge von Migration Wachstum Kegel beteiligt sind. Die Wirkung von Lockstoff-Moleküle, wie NGF oder Netrin, um schnell zu stimulieren Aktin-Filament-Polymerisation wird als eine lokale Erhöhung der Aktin Stacheldraht endet, von Aktin-Filament-Abtrennung von aktivierten ADF / Cofilin 10 erstellt, wie in den Abbildungen 1 und 2 dargest…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. James Bamburg und Mitglieder seines Labors für die Zusammenarbeit in diesen Studien. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt HD19950, EY07133 und durch Zuschüsse aus dem Minnesota Medical Foundation finanziert.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
Riferimenti
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