Expansão ex vivo de células tumorais T-reativa por Meios de 1/Ionomycin Bryostatin eo Common Gamma Cadeia Formulação Citocinas
Summary
Um protocolo eficiente para a<em> Ex vivo</em> Expansão das células tumorais T-reativa a partir de nós tumor de drenagem linfáticos ou outros tecidos linfóides secundários de portadores de tumor hosts é descrito. Este protocolo seletivamente as células do tumor se expande T específicas para uso em imunoterapia adotiva de câncer de mama.
Abstract
Foi relatado que pacientes com câncer de mama têm pré-existentes respostas imunes contra os seus 1,2 tumores. No entanto, tais respostas imunes não fornecem proteção completa contra o desenvolvimento ou a recorrência de câncer de mama. Para superar esse problema aumentando a freqüência de células tumorais T-reativa, a imunoterapia adotiva tem sido empregado. Uma variedade de protocolos têm sido utilizados para a expansão das células tumorais T específicas. Estes protocolos, no entanto, estão restritos ao uso de antígenos de tumor in vivo ex para a ativação de células T antígeno-específicos. Muito recentemente, citocinas gama comum cadeia, tais como IL-21 IL-2, IL-7, IL-15, e têm sido usados sozinhos ou em combinação para o reforço da anti-tumor respostas imunes 3. No entanto, não está claro o que a formulação seria melhor trabalhar para a expansão das células tumorais T-reativa. Aqui apresentamos um protocolo para a ativação seletiva e expansão de tumor reativa as células T a partir do modelo de camundongo transgênico FVBN202 de carcinoma de mama HER-2/neu positivo para uso em terapia adotiva de células T de câncer de mama. O protocolo inclui a ativação de células T com bryostatin-1/ionomycin (B / I) e IL-2, na ausência de antígenos tumorais durante 16 horas. B / I imita a ativação de sinais intracelulares que resultam na ativação de células T através do aumento da atividade da proteína quinase C e cálcio intracelular, respectivamente 4. Este protocolo especificamente ativa as células tumorais T específicas ao matar células T irrelevante. As células B / I-T ativadas são cultivadas com IL-7 e IL-15 por 24 horas e, em seguida, pulsadas com IL-2. Após 24 horas, as células T são lavados, dividir e cultivados com IL-7 + IL-15 por mais 4 dias. Eficácia do tumor especificidade e anti-tumor do ex vivo células T expandida é determinada.
Protocol
Discussion
Expansão seletiva das células tumorais reativa T com função anti-tumor efetoras pode ser alcançado através do protocolo proposto utilizando B / I ativação e expansão ex vivo com a cadeia gama citocinas IL-2, IL-7 e IL-15. Enquanto IL-2 é um fator de crescimento de células T que podem apoiar a diferenciação e expansão de células T antígeno-específicos, IL-7 pode inibir a apoptose das células T e apoiar a sua viabilidade durante a expansão. IL-15 pode suportar células T de memória que são im…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Agradecemos o apoio de VCU Massey Cancer Center e da Fundação Commonwealth para Pesquisa do Câncer.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bryostatin 1 | Sigma | B7431-10ug | ||
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | ||
| Mouse IL-7 | PeproTech | 217-17 | ||
| Mouse IL-15 | PeproTech | 210-15 | ||
| Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | ||
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | ||
| FBS | Gemini | 100-106 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | ||
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | ||
| β- mercaptoethanol | Sigma | M7522 | ||
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | ||
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Pharmingen | 556547 | ||
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | ||
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | ||
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | ||
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | ||
| formaldehyde | Polysciences | 04018 | ||
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | ||
| Light microscope | VWR | V200073 | ||
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Pharmingen | 555138 | ||
| Cell culture flasks | Greiner | 658175 |
Riferimenti
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
