Western Blot: préparation d'échantillons à la détection

1. Préparation des échantillons La première étape de Western blot est la préparation d'échantillons. Pour préparer les échantillons pour l'exécution d'un gel de cellules et de tissus doivent être lysées pour libérer les protéines d'intérêt. Une pratique, prêt à utiliser de réactifs qui est polyvalent et facile à utiliser pour l'extraction des protéines solubles est CytoBuster ou PhosphoSafe. Ces tampons d'extraction contiennent des détergents optimisé pour une extraction efficace des protéines solubles provenant de cellules de mammifères et d'insectes. Le doux, non ioniques de composition de réactif CytoBuster Extraction des protéines permet l'isolement des actifs endogènes fonctionnellement ou protéines exprimées sans avoir besoin d'un traitement secondaire tels que sonication ou de gel / dégel. PhoshoSafe a l'avantage de contenir quatre inhibiteurs de phosphatase. Pellet les cellules par centrifugation à faible vitesse (par exemple 5 min à 2500 xg), égoutter le culot cellulaire ainsi. Resuspendre les cellules dans le réactif CytoBuster Extraction des protéines en utilisant 150 pi par 10 6 cellules (quantité optimale de réactif CytoBuster Extraction des protéines peut varier en fonction de la taille des cellules). Incuber à température ambiante pendant 5 min. Transférer dans un tube approprié et de spin pendant 5 min à 16000 xg à 4 ° C. Transfert effacé surnageant (extrait cellulaire) dans un nouveau tube et procéder à l'analyse. Pour l'extraction des protéines spécialisées, nous recommandons d'utiliser notre haute qualité Kits ProteoExtract. EMD a plus d'une douzaine des kits pour l'isolement des mitochondries, l'extraction du protéome subcellulaire, l'extraction des protéines transmembranaires, et bien d'autres. S'il vous plaît visitez notre page d'atterrissage Ouest blot pour plus de détails. EMD vend également une grande variété de protéase et inhibiteur de phosphatase ensembles cocktail. Dès que survient la lyse, la protéolyse, la déphosphorylation et de dénaturation de commencer. Ces événements peuvent être considérablement ralentie si les échantillons sont conservés sur la glace ou à 4 ° C en tout temps et les inhibiteurs appropriés sont ajoutés frais à la mémoire tampon de lyse. S'il vous plaît visitez notre page d'atterrissage Ouest blot pour plus de détails. 2. SDS-PAGE La deuxième étape du Western blot est la séparation des protéines. Les protéines sont séparées en fonction du poids moléculaire. Vous pouvez faire votre propre gel PAGE, cependant, nous allons utiliser une commercialement préfabriqués gel. Après la préparation de votre échantillon, vous êtes prêt à déterminer la concentration en protéines. EMD a deux kits pour ce pour mesurer la concentration, l'un étant le Kit de non-ingérence et de protéines Assay l'autre étant le kit BCA Protein Assay. Une fois que la concentration en protéines est évaluée, nous sommes prêts à préparer notre échantillon pour le chargement du gel. Anticorps reconnaissent généralement une petite portion de la protéine d'intérêt (appelé l'épitope) et ce domaine peut résider dans la conformation 3D de la protéine. Pour permettre l'accès de l'anticorps à cette partie, il est nécessaire de déplier la protéine. Pour dénaturer, utilisez un tampon de chargement avec le sulfate de détergents anioniques dénaturant dodécylsulfate de sodium (SDS), et faire bouillir le mélange à 95-100 ° C pendant 5 minutes. Un tampon de chargement facile et pratique à utiliser est tampon d'échantillon 4X. Chargez la première voie du puits avec marqueur protéique Trail Mix. Ce marqueur a trois bandes de référence qui vous permettent de surveiller l'électrophorèse. Lorsque le gel est coloré, les bandes 10 sont visibles allant de 10 à 225 kDa. Remplir l'appareil d'électrophorèse avec beaucoup d'tampon. Pour les gels PAGE, ce n'est généralement 1X Tris-glycine. Pour les recettes de mémoire tampon détaillées, visitez la page Western blot. EMD offre de haute qualité réactifs tampons avec notre ligne de produit chimique OmniPur. Exécutez le gel à 220 pendant 1 heure. Une fois que les protéines sont séparés, le gel coloration au bleu de Coomassie pour assurer les protéines ont migré équitablement et uniformément. RAPIDstain est une tache ultra-sensible qui est prêt à utiliser. Pas de décoloration est nécessaire. 3. La protéine de transfert Tout comme les protéines avec une charge électrique peut être amené à voyager à travers un gel dans un champ électrique, ne peut donc les protéines être transféré dans un champ électrique à partir du gel sur une membrane, étant soit PVDF ou de nitrocellulose. Aujourd'hui, nous allons faire un transfert humide. En transfert humide, le gel et la membrane sont pris en sandwich entre une éponge et du papier (éponge / papier / gel / membrane / papier / éponge) et tous sont serrés ensemble, après s'être assuré de bulles d'air ont formé entre le gel et la membrane. Le sandwich est immergé dans du tampon de transfert à laquelle un champ électrique est appliqué. Les protéines chargées négativement de voyage vers l'électrode chargée positivement, mais la membrane ne les arrête, les lie, et les empêche de continuer le. Deux types de membranes sont disponibles: la nitrocellulose et de PVDF. Les deux fonctionnent bien. Aujourd'hui, nous allons utiliser le PVDF. Membranes PVDF nécessitent trempage dans méthanol pour quelques minutes, suivi par du tampon de transfert de la glace froide pendant 5 minutes. Le gel a également besoin de s'équilibrer pendant quelques minutes dans un tampon de transfert de la glace froide. Ne pas le faire peut rétrécir le gel pendant le transfert. Le tampon pour le transfert par voie humide est 1X Tris-glycine avec 20% de méthanol. Les préparatifs de tampon détaillées sont disponibles sur notre site Web. Une fois le transfert est terminé, c'est une bonne idée de visualiser des protéines pour assurer le transfert, même avec des poches d'air. Cela peut se faire facilement avec RedAlert Western Blot Stain. Cette tache est prêt à utiliser et de décoloration peut se faire facilement avec de l'eau. 4. Les anticorps et les réactifs accessoires La première étape en faisant sonder et d'anticorps à l'antigène est de bloquer la membrane. Blocage de la membrane empêche la liaison de fond non spécifique. Soit non gras du lait ou des BSA peut être utilisé comme une solution de blocage. Toutefois, lorsque vous utilisez anticorps phospho-spécifiques, il n'est pas recommandé d'utiliser du lait car cela fera de fond élevé. EMD offre plusieurs de haute qualité réactifs de blocage, notamment SeaBlock, qui est un agent non-bloquant et de mammifères QuickBlocker BLOT, qui est préparé, prêt à utiliser bloquant. Nous avons aussi de haute qualité BSA (Fraction V) disponibles. Incuber la membrane 1 heure à température ambiante sous agitation douce. Laver trois fois dans TBST ou PBST après incubation. Un moyen facile et pratique de faire ou de TBST PBST est d'utiliser notre comprimés (PBS TWEEN Comprimés / SCT Tablets TWEEN) Une fois la membrane a été bloquée, vous êtes prêt à incuber avec l'anticorps primaire. EMD a été propose un portefeuille étendu d'anticorps exceptionnelle avec la meilleure garantie d'anticorps dans l'industrie depuis plus de 30 ans. N'oubliez pas que tous les anticorps EMD, nous offrons un plein 100% sans risque de garantie. Achat d'un anticorps et l'utiliser pour toute la spécificité d'espèce ou de l'application que vous désirez. Si les anticorps ne fonctionnent pas à votre satisfaction, nous vous fournirons un crédit complet pour être utilisé sur n'importe quel autre produit. Pour plus de détails, s'il vous plaît visitez notre page web occidentaux buvard. Aujourd'hui, nous allons être en incubation de nos anticorps primaire avec une solution d'une SignalBoost. SignalBoost est un excellent produit qui permet à votre signal pour être amélioré de manière significative. Simplement incuber votre anticorps primaire dans la Solution 1 et incuber pendant 1 heure ou comme vous le feriez normalement. Il n'est pas nécessaire d'ajouter d'autres agents de blocage. Alternativement, vous pouvez utiliser BSA ou poudre de lait écrémé comme agent de blocage. Laver avec du TBST. Nous faisons TBST utilisant le prêt-à-dissoudre le comprimé TBST. Incuber vos anticorps secondaire en utilisant la solution 2 de SignalBoost. Incuber l'anticorps secondaire dans le tampon de blocage pendant 1 heure. Lavez la membrane à nouveau plusieurs fois avec TBST. 5. Détection Pour conjuguer HRP Anticorps secondaires, ECL est traditionnellement utilisé. Un excellent réactif ECL que nous offrons est RapidStep. Les avantages de RapidStep sont que pas de mélange de luminal ou un amplificateur est nécessaire. Il suffit de vaporiser la membrane à quelques reprises et de développer en utilisant les films radiographiques. RapidStep offre une sensibilité faible pictogramme ainsi que émettant de la lumière pour un maximum de 2 heures après l'addition du substrat.