الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف
Summary
النشاف الغربي هو أسلوب التحليل المستخدمة للكشف عن بروتينات معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج.
Abstract
النشاف الغربي هو أسلوب التحليل المستخدمة للكشف عن بروتينات معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج. ويستخدم الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الأصلي أو التشويه والتحريف من طول ببتيد (شروط تغيير طبيعة) أو عن طريق هيكل 3 – D من البروتين (أصلي / عدم تغيير طبيعة الظروف). ثم يتم نقل البروتينات إلى غشاء (عادة النيتروسليلوز أو PVDF) ، حيث يتم بحث (الكشف) باستخدام أجسام مضادة محددة للبروتين الهدف.
Protocol
1. تحضير العينة الخطوة الأولى في غرب النشاف هو إعداد العينة. لإعداد العينات لتشغيل الخلايا والأنسجة هلام يلزم lysed للافراج عن بروتينات الفائدة. ومريحة ، والجاهزة للاستخدام كاشف التي هي متعددة وسهلة الاستخدام لاستخراج البروتين غير قابلة للذوبان أو CytoBuster PhosphoSafe. تحتوي هذه المخازن استخراج المنظفات الأمثل لكفاءة الاستخلاص من البروتينات القابلة للذوبان من خلايا الثدييات والحشرات. لطيف ، غير الأيونية تكوين البروتين CytoBuster الكاشف استخراج تمكن من العزلة الذاتية الفعالة وظيفيا أو البروتينات وأعرب دون الحاجة إلى المعالجة الثانوية مثل صوتنة أو تجميد / الذوبان. PhoshoSafe له فائدة اضافية لاحتواء مثبطات الفوسفاتيز الأربعة. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي سرعة منخفضة (على سبيل المثال 5 دقائق في 2500 XG) ، بيليه الخلية استنزاف جيدا. Resuspend الخلايا في البروتين CytoBuster باستخدام الكاشف استخراج 150 ميكرولتر في الخلايا 6 10 (المبلغ الأمثل للبروتين CytoBuster الكاشف استخراج قد تختلف استنادا إلى حجم الخلية). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نقل إلى أنبوب مناسبة وتدور لمدة 5 دقائق في XG 16000 في 4 درجات مئوية. مسح نقل طاف (استخراج الخلايا) إلى أنبوب جديد والمضي قدما في التحليل. لاستخراج البروتين المتخصصة ، ونحن نوصي باستخدام لدينا عالية الجودة أطقم ProteoExtract. EMD ما يزيد على اثني عشر مجموعات لعزل الميتوكوندريا ، التحت خلوية استخراج بروتيوم ، عبر الغشاء استخراج البروتين ، وغيرها الكثير. يرجى زيارتنا لطخة غربية الصفحة المقصودة لمزيد من التفاصيل. EMD تبيع أيضا تشكيلة واسعة من مجموعات البروتيني والفوسفاتيز كوكتيل المانع. حالما يحدث تحلل ، التحلل البروتيني ، ونزع الفسفات تمسخ تبدأ. يمكن أن تكون هذه الأحداث باستمرار تباطأ بشكل كبير إذا ما حافظت على عينات من الجليد أو عند 4 درجة مئوية تضاف في كل الأوقات ومثبطات مناسبة جديدة للتحلل العازلة. يرجى زيارتنا لطخة غربية الصفحة المقصودة لمزيد من التفاصيل. 2. SDS – PAGE الخطوة الثانية في غرب النشاف هو فصل البروتين. يتم فصل البروتينات على أساس الوزن الجزيئي. يمكنك جعل الصفحة الخاصة بك هلام ، ولكن سنكون باستخدام تجاريا مسبقة الصنع هلام. بعد إعداد نموذج الخاص بك ، كنت على استعداد لتحديد تركيز البروتين. EMD ومجموعتين لهذا لقياس التركيز ، واحد يجري الفحص البروتين عدم التدخل كيت والآخر يجري الفحص البروتين BCA كيت. حالما يتم تقييم تركيز البروتين نحن مستعدون لإعداد نموذج لدينا لتحميل الجل. الأضداد تعترف عادة جزء صغير من البروتين من الفائدة (ويشار إليه حاتمة) وهذا المجال قد تتواجد داخل التشكل 3D من البروتين. لتمكين وصول الأجسام المضادة لهذا الجزء من الضروري أن تتكشف البروتين. لتفسد ، واستخدام العازلة تحميل مع أنيوني كبريتات الصوديوم المنظفات تغيير طبيعة دوديسيل (SDS) ، ويغلي الخليط في 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وجود مخزن مؤقت التحميل سهلة ومريحة لاستخدام الاحتياطي 4X هو نموذج. تحميل المسار الأول من البئر مع تريل ميكس ماركر البروتين. وهذه العلامة المرجع العصابات الثلاث التي تسمح لك لرصد الكهربائي. عندما اتسخت الجل ، والعصابات 10 مرئية تتراوح 10-225 كيلو دالتون. سد الوحدة الكهربائي مع تشغيل العازلة. لPAGE المواد الهلامية ، وهذا هو عادة تريس 1X – جليكاين. العازلة عن وصفات مفصلة ، يمكنك زيارة صفحة الغربية النشاف. EMD عروض عالية الجودة مخازن الكواشف الكيماوية مع خطنا OmniPur. تشغيل في هلام 220V لمدة 1 ساعة. مرة واحدة في البروتينات وفصلها ، وصمة عار مع الجل الأزرق Coomassie لضمان البروتينات هاجروا بالتساوي وبشكل موحد. RAPIDstain هو وصمة عار فائقة الحساسية التي هي جاهزة للاستخدام. ليس هناك حاجة destaining. 3. نقل البروتين تماما كما يمكن أن يتسبب البروتينات مع شحنة كهربائية من خلال السفر إلى هلام في حقل الكهرباء ، بحيث يمكن نقل البروتينات في مجال كهربائي من الجل على غشاء ، ويجري إما PVDF أو النيتروسليلوز. اليوم سوف نقوم بنقل الرطب. في مجال نقل الرطب ، وتقع الجل والغشاء بين الإسفنج ورقة (الاسفنج / ورقة / هلام / غشاء / ورقة / الاسفنج) ، وفرضت جميع بإحكام معا بعد التأكد من أي فقاعات هواء شكلت بين جل والأغشية. الغارقة في شطيرة في نقل العازلة التي يتم تطبيق حقل كهربائي. البروتينات المشحونة سلبا السفر نحو القطب المشحون إيجابيا ، ولكن توقف عن غشاء لهم ، يربط بينها ، ويمنعها من الاستمرار في. نوعان من الأغشية متوفرة : النيتروسليلوز وPVDF. تعمل بشكل جيد على حد سواء. اليوم سنكون باستخدام PVDF. الأغشية PVDF تتطلب تمرغ في methanoل لبضع دقائق ، ثم نقل العازلة الجليد البارد لمدة 5 دقائق. الجل يحتاج أيضا للتوازن لبضع دقائق في نقل العازلة الجليد الباردة. قد لا تفعل ذلك تقليص هلام أثناء النقل. المخزن المؤقت لنقل الرطب 1X تريس – جليكاين مع الميثانول 20 ٪. استعدادات مفصلة العازلة متاحة على موقعنا على الانترنت. بمجرد اكتمال عملية النقل ، انها فكرة جيدة لرؤية البروتينات لضمان نقل حتى مع عدم وجود جيوب الهواء. ويمكن بسهولة أن يتم ذلك مع RedAlert الغربية وصمة عار وصمة عار. هذه وصمة عار على استعداد للاستخدام ويمكن القيام به بسهولة مع destaining المياه. 4. الأجسام المضادة والكواشف ملحقة الخطوة الأولى في التحقيق والقيام على الضد مستضد هو كتلة الغشاء. حظر يمنع الغشاء غير محددة وملزمة الخلفية. ويمكن استخدام إما منزوع الدسم أو اللبن BSA كحل حظر. ومع ذلك ، عند استخدام الفوسفات محددة الأجسام المضادة ، فمن غير المستحسن استخدام الحليب لأنه سيتسبب في ارتفاع الخلفية. EMD عدة عروض عالية الجودة الكواشف حظر ، بما في ذلك SeaBlock ، وهو عامل غير الثدييات الحجب وQuickBlocker BLOT ، الذي يعد وجاهزة للاستخدام عامل محصر. لدينا أيضا عالية الجودة BSA (V الكسر) متوفرة. احتضان الغشاء 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. يغسل ثلاث مرات في TBST أو PBST بعد الحضانة. طريقة سهلة ومريحة لجعل TBST أو PBST هو استخدام أقراص لدينا (PBS توين أقراص / أقراص TBS توين) مرة واحدة وقد تم حظر الغشاء ، كنت على استعداد لاحتضان مع الأجسام المضادة الأولية. وقد تقدم EMD مجموعة شاملة من الأضداد استثنائية ، وأفضل ضمانة للأجسام المضادة في هذه الصناعة لأكثر من 30 عاما. تذكر أن مع كل الأضداد EMD ، ونحن نقدم كامل 100 ٪ لا يوجد ضمان للخطر. شراء الأضداد واستخدامها لأية خصوصية الأنواع أو التطبيق الذي يرغبه. إذا كان الضد لا يعمل بشكل يرضيك ، فإننا سوف توفر الائتمان الكامل ليتم استخدامه على أي منتج آخر. لمزيد من التفاصيل ، يرجى زيارة صفحة الويب النشاف الغربية. اليوم سنكون احتضان الضد لدينا الأولية باستخدام حل 1 من SignalBoost. SignalBoost هو منتج كبير السماح تعزيز إشارة إلى حد كبير. ببساطة احتضان الضد الخاص الأساسي في الحل (1) ويحضن لمدة 1 ساعة أو كما تفعل عادة. ليست هناك حاجة لإضافة المزيد من عوامل عرقلة. بدلا من ذلك ، يمكنك استخدام جيش صرب البوسنة أو غير دهن الحليب الجاف كعامل حظر. يغسل مع TBST. نجعل TBST باستخدام – الجاهزة للقرص TBST حل. احتضان الضد الخاص به حل الثانوية 2 من SignalBoost. احتضان الجسم المضاد الثانوي في حجب العازلة لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء مرة أخرى عدة مرات مع TBST. 5. كشف HRP عن الأجسام المضادة الثانوية التصريف ، يستخدم عادة ECL. وكاشف ممتازة ECL نقدمها هي RapidStep. مزايا RapidStep هي أنه لا يلزم من الاختلاط أو محسن اللمعية. رذاذ ببساطة الغشاء بضع مرات ، وتطوير استخدام الأشعة السينية الفيلم. RapidStep عروض حساسية منخفضة فضلا عن الرسم التخطيطي للضوء ينبعث منها لمدة تصل إلى 2 ساعة بعد إضافة الركيزة.
Discussion
في هذا العرض الفيديو ، فقد أبرزنا الخطوات الرئيسية في غرب النشاف التي هي إعداد العينات ، SDS – PAGE ، غشاء حجب / التحقيق مع الأجسام المضادة ، والكشف. لكل خطوة من العملية ، يجب استخدام البروتوكولات المناسبة والكواشف المناسبة لتحقيق نتائج عالية الجودة.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
Riferimenti
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. ‘. W. e. s. t. e. r. n. blotting’: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , (2010).
- O’Malley, D. e. r. v. i. a. Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
Citazione di questo articolo
Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359, doi:10.3791/2359 (2010).