Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין
Summary
Oligonucleotides ניתן להשתמש כדי לאתר ספציפי תחליף נוקלאוטיד בודד של גני מטרה transfected בשני<em> אנופלס gambiae</em> ו<em> אנופלס stephensi</em> תאים.
Abstract
טפילים Plasmodium, הסוכן סיבתי של מלריה, המועברות דרך עקיצות של יתושים נגועים אנופלס וכתוצאה מכך יותר מ -250 מיליון זיהומים חדשים בכל שנה. למרות עשורים של מחקר, אין עדיין חיסון נגד מלריה, המדגישה את הצורך של אסטרטגיות שליטה רומן. גישה אחת היא השימוש החדשני של יתושים מהונדסים גנטית כדי לשלוט ביעילות טפיל המלריה הילוכים. שינויים מכוונת של המסלולים התא איתות היתוש, דרך mutagenesis ממוקד, נמצאו להסדיר טפיל הפיתוח 1. מתוך מחקרים אלה, אנו יכולים להתחיל לזהות מטרות הגן פוטנציאל לשינוי. Mutagenesis ממוקד הסתמכה באופן מסורתי על רקומבינציה הומולוגיים בין גן המטרה מולקולת דנ"א גדולים. עם זאת, הבנייה והשימוש כגון מולקולות דנ"א מורכבות עבור הדור של שורות תאים הפך ביציבות הוא זמן יקר, רב יעיל לעתים קרובות. לכן, האסטרטגיה באמצעות נעול גרעין חומצה שונה oligonucleotides (LNA לפיירפוקס) מספק אלטרנטיבה יעילה מציגה תחליפים מלאכותיים נוקלאוטיד בודד לתוך episomal ו כרומוזומליות הגן מטרות DNA (הנסקרת ב 2). LNA-ON בתיווך mutagenesis ממוקד נעשה שימוש כדי להציג את נקודת מוטציות בגנים עניין של תאים בתרבית שמרים והן בעכברים 3,4. אנחנו מראים כאן LNA-RSS יכול לשמש כדי להציג שינוי של נוקלאוטיד יחיד מטרה episomal transfected כי התוצאות מתג מכחול ביטוי חלבון פלואורסצנטי (BFP) לירוק ביטוי פלורסנט חלבון (GFP) הן gambiae אנופלס ו אנופלס תאים stephensi . המרה זו ממחישה בפעם הראשונה כי mutagenesis יעיל של גני מטרה בתאים יתוש יכולה להיות מתווכת על ידי LNA תוספות ומציע כי טכניקה זו עשויה להיות ישימה mutagenesis מטרות כרומוזומליות במבחנה in vivo.
Protocol
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה במבחנה ראיות המרה ממוקד של נוקלאוטיד יחיד יעד הגן episomal הבאים transfection של LNA לפיירפוקס לתוך A. stephensi וא gambiae תאים. LNA-ON בתיווך המרה הגן דורש גיוס של אתר ספציפי בתגובה DNA תיקון: הנתונים שלנו מצביעים על כך התאים יתוש יכול לתמוך זה מנגנון mutagenesis אתר …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות אבי ספינר במרכז הלאומי לחקר פרימטים קליפורניה לסיוע שלה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי מימון מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AI073745, AI080799 ו AI078183.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
Riferimenti
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
