Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

1. Zubereitung von Fisch für gepaarte Recordings Vor Beginn des Verfahrens vorzubereiten fünf Lösungen, darunter: Bath Solution, Badlösung mit Tricaine (MS222), Bad-Lösung mit Formamid, Neuron Internal Solution und Muscle Internal Solution. Anschließend sammeln einen einzigen Larven Zebrafisch im Alter von 72 bis 96 Stunden und in Badlösung mit Tricaine. Innerhalb einer Minute Einwirkzeit des Anästhetikums, die Fische nicht auf Berührung reagieren. Den Fisch auf einer Plastikschale und mit einem Stereomikroskop, mit einem Doppel-Rasierklinge zu enthaupten. Übertragen Sie die Fische, um ein Glas Aufnahme Kammer mit Sylgard beschichtet und mit Badlösung. Befestigen Sie an jedem Ende durch Einsetzen elektrolytisch geschärften Wolfram Stifte durch die Chorda. Erstellen Sie einen Hautlappen am rostralen Ende des Fisches mit einer Nadel, die eine ausreichend Grip für ein Paar feine Pinzette zur Verfügung stellt. Entfernen Sie die darüber liegende Haut durch Greifen es in der Nähe des rostralen Stift mit einer feinen Pinzette. Peel langsam in die kaudale Richtung die Haut abziehen. Behandeln Sie den Fisch mit 3 ml Badlösung mit Formamid für 3-5 Minuten, um Muskelkontraktionen, die mit Aufnahmen stören könnte, zu blockieren. Wash 5 mal mit normalen Bad Solution. Nehmen Sie Teil der oberflächlichen Muskulatur über 5 bis 6 Segmente, indem Sie vorsichtig die Verschrottung mit der Seite eines Wolframstift. Übertragen Sie die Fische zu einem aufrechten Mikroskop in einen Faraday-Käfig, um elektrische Störungen zu schützen. Das Mikroskop ist mit einer festen Bühne ausgestattet, großer Arbeitsabstand 40x und Zoom von .5 bis 4x. Das Mikroskop befindet sich auf einem motorisierten XY-Übersetzung Bühne montiert, um die Vorbereitung zwischen Nerv und Muskel unter hoher Leistung zu bewegen. Der Einsatz von Differential-Interferenz-Kontrast-Optik trägt dazu bei, die Neuronen zu visualisieren. Unter 0,5 x-Zoom, verwenden Sie eine weite Bohrung 15-Mikrometer-Pipette darüberliegenden Muskel entfernen und setzen das Rückenmark. Negativer Druck wird durch eine 3 cc Einwegspritze und Muskelzellen angewendet werden entfernt eins nach dem anderen. Dieses Verfahren ist für 5 bis 6 dorsalen Segmente der Skelettmuskulatur wiederholt. Das gleiche weite Bohrung Pipette wird verwendet, um auch entfernen, die beiden oberen Schichten der ventralen Muskulatur zum Ziel schnell Skelettmuskulatur zu erhalten. Damit ist die Vorbereitung für gepaarte Aufnahmen und das Mikroskop Zoom ist auf ca. 1,6 erhöht. 2. Gepaart Recordings von CaP Motor-Neuron-und Target Muskelzellen Das gereinigte Segmente werden gescannt, um die CaP Neuronen zu finden. Jeder Hemi-Segment des Rückenmarks enthält einen großen, 10 Mikron Durchmesser, CaP Motor-Neuron. Diese Tropfenform Soma ist oberflächlich unter der spinalen Dura in der Nähe des kaudalen Endes der segmentalen Grenze entfernt. Ein CaP Neuron ist für die Aufnahme ausgewählt und das ventrale Zielmuskel in den angrenzenden kaudalen Segment gescannt wird, um die Integrität zu überprüfen. Zwei aufgesetzte Elektroden sind für die Aufnahme, einen für das Neuron und eine zweite für den Muskelaufbau positioniert. Die obere Elektrode hat eine flache Kegel für das Eindringen der harten spinalen Dura und Bahnöffnung von etwa 2 Mikrometer. Die untere Elektrode hat eine steilere Kegel für geringen Widerstand Voltage-Clamp-Aufzeichnung der Skelettmuskulatur Position des Neurons Elektrode in einem Winkel von etwa 30 Grad auf der spinalen Dura einzudringen, etwa ein halbes Segment rostral um den ausgewählten CaP Neurons. Schieben Sie die Elektrode mit einem axialen Manipulator, während eine sanfte kontinuierliche positive Druck von etwa 60 Millimeter Quecksilber. Da die Elektrode bricht durch die Dura, kann die Kappe Neuron durch die Perfusion von der Elektrode verschoben werden, erfordern eine Neujustierung des Fokus. Wenn die Elektrode berührt die CaP Neuron soma Überdruck freigesetzt und führt in der Regel sofortige Bildung eines Gigaohm Dichtung. Doch in einigen Fällen, wo eine Abdichtung versagt zu bilden, wird es notwendig, einen sanften Unterdruck anwenden. Nach Siegel Bildung ist das Elektrodenpotential angepasst, um-80mV und Anwendung von Unterdruck Brüche der Zellmembran. Die GAP-Neuron ist mit einem Eingangswiderstand von 140 bis 180 Mega-Ohm und ein Aktionspotential, dass Überschwinger 40 Millivolt aus. Dies ist durch die Injektion schrittweise Erhöhung depolarisierende Schritte unter Stromzange bis das Aktionspotential ausgelöst wird getestet. Als nächstes wird das Mikroskop auf ventralen Muskel mit dem XY motorisierten Übersetzer unter hohen Strom verlegt. Eine schnelle Muskelzelle wird aus dem Zielfeld ausgewählt. Der Muskel-Elektrode ist auf das Ziel Muskelzelle unter Überdruck, der beim Loslassen, bildet eine Gigaohm Dichtung fortgeschritten. Das Elektrodenpotential wird auf -50 Millivolt eingestellt Natrium-Kanäle inaktivieren und unter leichtem Saugen der Zellmembran ist gerissen. Ein Rückgang der Widerstand gegen die 100 bis 200 Mega-Ohm und das plötzliche Auftauchen der großen kapazitiven Transienten-Eintrag. Um zu testen,für gepaarte der Aufnahme wird die Motor-Neuron depolarisiert durch schrittweise größere Injektionen von Strom, bis ein Aktionspotential ausgelöst wird. An dieser Stelle eine Endplatte Strom sollte in der Muskulatur hervorgerufen werden. Fortsetzung Stimulation der Motoneuronen bei 1 Hertz Ergebnisse in Endplatte Ströme ohne Ausfall. Da die Reizfrequenz auf 100 Hertz erhöht wird die Endplatte Strömungen schwanken in Amplitude und unterziehen funktionalen Erschöpfung innerhalb von 10 Sekunden Stimulation. 3. Repräsentative Ergebnisse Typischerweise ist das Neuron eine Aufnahmedauer von bis zu einer Stunde stabil, aber die Muskelzellen verschlechtern, da eine Erhöhung der Serienwiderstand wider. In diesem Fall wird der Versuch entweder beendet oder anderen Muskelzelle ist Patch gespannt. Alle Aufnahmen sollten innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. Abbildung 1. Recordings der Motoneuron Aktionspotential (AP, oben) und die damit verbundenen muskulären Endplatte aktuellen (EPC, unten). Die Aktion Potenzial für eine CaP Neuron sollte Überschwingen +40 mV und der EPC sollte innerhalb von 300 us und Verfall entlang einer exponentiellen Zeitverlauf mit einer Zeitkonstante unter 1 ms steigen. Name Rezept Bad Solution (in mM) 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7,8 Badlösung mit Tricaine Bath Lösung mit 0,02% Tricaine Badlösung mit Formamid Bath Lösung mit 2M Formamid Neuron Internal Solution (in mM) 115 K-Gluconat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2 Muscle Internal Solution (in mM) 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 Tabelle 1. Solutions.