In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie
Summary
Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van intacte<em> Drosophila melanogaster</em> Larven. We hebben gebruik gemaakt van de vluchtige anesthetica desfluraan om voor herhaalde beeldvorming op sub-cellulair resolutie en re-identificatie van structuren zorgen voor maximaal een paar dagen<sup> 1</sup>.
Abstract
Recente verbeteringen in optische beeldvorming, genetisch gecodeerd fluoroforen en genetische instrumenten die een efficiënte inrichting van de gewenste transgene dier lijnen in staat hebben gesteld biologische processen te bestuderen in de context van een leven, en in sommige gevallen zelfs gedragen, organisme. In dit protocol zullen we beschrijven hoe intact Drosophila larven, met behulp van de vluchtige anesthetica desfluraan, aan de ontwikkeling en plasticiteit van synaptische populaties op sub-cellulair resolutie 1-3 te volgen verdoven. Terwijl andere nuttige methoden om de Drosophila melanogaster larven verdoven zijn eerder beschreven 4,5,6,7,8, het protocol hierin gepresenteerd toont significante verbeteringen te wijten aan de volgende combinatie belangrijkste eigenschappen: (1) Een zeer hoge mate van verdoving, zelfs de hartslag wordt gearresteerd waardoor laterale resolutie tot 150 nm 1, (2) een hoge overlevingskans van> 90% per cyclus verdoving, waardoor de opname van meer dan vijf tijdstippen gedurende een periode van uren tot dagen 2 en ( 3) een hoge gevoeligheid waardoor we in twee gevallen aan de dynamiek van eiwitten die worden uitgedrukt in fysiologische hoeveelheden te bestuderen. In detail, we waren in staat om de postsynaptische glutamaat receptor subeenheid GluR-IIA uitgedrukt via de endogene promotor 1 in stabiele transgene lijnen en de exon val lijn FasII-GFP een te visualiseren. (4) In tegenstelling tot andere methoden 4,7 de larven kunnen worden afgebeeld, niet alleen in leven, maar ook intact zijn (dwz niet-ontleed), zodat observatie te komen over een aantal dagen een. De bijhorende video details van de functie van de afzonderlijke onderdelen van de in vivo beeldvorming kamer 2,3, de correcte montage van de larven, de verdoving procedure, hoe opnieuw vaststellen van specifieke posities binnen een larve en de veilige verwijdering van de larven van de beeldvorming kamer.
Protocol
Discussion
De gepresenteerde methode is in eerste instantie ontwikkeld voor glutamaat synapsen onderzoek op het lichaam muur spieren van Drosophila melanogaster larven. De Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gekenmerkt door een stereotype cyto-architectuur van spieren en neuronen en is daardoor uitermate geschikt voor in vivo beeldvorming. Echter, de beschreven verdoving protocol niet beperkt tot de beeldvorming van de NMJ, de transparantie van de Drosophila larven vergemakkelijkt de aanpassing van de beschreven protocol voor de ontwikkeling van organen studie, migratie van cellen, het transport van axonale cargo en sub-cellulaire reorganisatie binnen de cellen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Andreas Schönle, Max-Planck-Instituut voor Biofysische Chemie, Duitsland en David J. Sandstrom, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA voor technisch advies. Wij danken Frank Kotting, European Neuroscience Institute, Göttingen voor de bouw van de beeldvorming kamer en de verdoving apparaat. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Alzheimer Forschung Initiative TMRYZ werd ondersteund door een gemeenschap van de China Scholarship Council, SBH door een gemeenschap van de Graduate School for Cellular and Molecular Neuroscience, Universiteit van Tübingen.
Materials
Reagents:
- Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
- Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
- Fly culture medium
Equipment:
- Inverted confocal microscope
- Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
- Small paintbrush as used to sort flies
- Incubator
- Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
- Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)
Riferimenti
- Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
- Rasse, T. M. . In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , (1988).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Vinegoni, C. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. J Vis Exp. , (2009).
- Lin, C. Y. Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy. Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &. a. m. p. ;. a. m. p., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
