Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים תרבות, כל ההליכים פרוטוקול זה מבוצעות באמצעות שיטות מעבדה סטרילית שנערך מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. לפני שמתחילים, להבטיח כי התקשורת היא כל equilibrated ל 37 ° C ו בגז כראוי. הכנת Geltrex מצופה צלחות תרבות הערה: ראה נספח לשימוש CELLstart מנות תרבות מצופה. One הפשירי שפופרת של Geltrex (1 מ"ל) לאט 2-8 ° C ו 1:100 לדלל אותו 99 מ"ל של נוק D-MEM/F-12. מערבבים בעדינות את הפתרון. הערה: יש שורות תאים iPS עשויה לדרוש דילול שונים Geltrex לצמיחה אופטימלית. ראו נספח דילולים חלופיים. מכסים את כל פני השטח של כל מנה תרבות עם פתרון Geltrex (1 מ"ל למנה 35 מ"מ, 1.5 מ"ל למנה 60 מ"מ). חותם כל צלחת עם Parafilm כדי למנוע ייבוש דגירה את הכלים במשך שעה 1 ב 37 ° C. הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את Geltrex מצופה מנות התרבות בשעה 4 ° C עד חודש 1. חותם כל צלחת עם Parafilm למנוע Geltrex מהתייבשות. לפני השימוש, העברת Geltrex מצופה הכלים ברדס זרימה למינרית ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ – 1 שעה). הכנת בנוקאאוט השלם SR מזין ללא בינוני כדי להכין 1 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון בסיסי FGF, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C למשך עד 6 חודשים. יסוד FGF 10 מיקרוגרם D-PBS 990μL 10% BSA 10 μL הערה: ניתן להחליף BSA עם HSA או SR נוק בריכוז זהה. כדי להכין 50 מ"ל של תמיסת מ"ג / מ"ל ​​2 Dispase, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. סנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. Dispase 100 מ"ג D-PBS 50 מ"ל כדי להכין 100 מ"ל של SR בנוקאאוט להשלים מזין חינם (KSR-FF) בסביבה נקייה מחיידקים, לשלב את המרכיבים המפורטים בטבלה להלן. רכיב במלאי ריכוז הריכוז הסופי נפח נוק DMEM/F12 (לא קט. 12660-012) – 1X 76.8 מ"ל GlutaMAX-I (קט 'מס' 35050-061) 200 מ"מ 2 מ"מ 1 מ"ל נוקאאוט SR (לא קט. 10828-028) – 20% 20 מ"ל נוקאאוט SR-GFC (לא קט. A10580-01) 50X 1X 2 מ"ל bFGF (לא קט. PHG0024). 10 מיקרוגרם / מ"ל 20 ng / mL 200 μL אתה יכול לאחסן את המדיום KSR-FF ב 2-8 מעלות עד שבוע. רגע לפני טרום equilibrating המדיום להשלים לטמפרטורה וגזים, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף נפח הנדרש mercaptoethanol 2 (55 מניות בריכוז mM) בריכוז סופי 0.1 מ"מ. לדוגמה, כדי להכין 100 מ"ל של KSR-Fבינוני F להוסיף μL 182 מ"מ 55 2 mercaptoethanol (1:550 דילול) לחילופין, 2 mercaptoethanol ניתן להוסיף בינוני השלימה 1X ומאוחסנים ב 2-8 מעלות צלזיוס עד שבוע. הכנת הקפאה / cryopreservation בינוני בינוני cryopreservation מורכב משני התקשורת; בינוני מקפיא A ו-B בינוני הקפאת הם הוסיפו לתאים בזמנים שונים חייבים להישאר מופרדים. הם כל אחד 50% מהנפח הכולל של בינונית cryopreservation הצורך. סך היקף בינוני cryopreservation שצריך הוא 1 מ"ל על כל בקבוקון להיות קפוא. צלחת 90% 60mm ומחוברות של hESC יכול לשמש לבנק 2 בקבוקונים של hESC בתקשורת cryopreservation. הכן נפח מספיק בינונית כל הקפאה עם תוספת 2-5 מ"ל כדי להבטיח overage. בינוני הקפאה (50% של נפח סופי): 50% DMEM/F12 50% KSR בינוני B מקפיא (50% של נפח סופי): 80% DMEM/F12 20% DMSO דוגמה: אם אתה מקפיא 20 בקבוקונים של תאים, תצטרך 20mL של cryopreservation בינוני. הוסף 4mL עבור overage עבור סכום כולל של בינונית cryopreservation 24mL. כלומר, תצטרך 12mL של הקפאת בינוני (50% 24mL) ו 12mL של B בינוני הקפאה (50% 24mL). בינוני הקפאה (12 מ"ל): 6 מ"ל DMEM/F12 6 מ"ל KSR בינוני B מקפיא (12 מ"ל): 9.6 מ"ל DMEM/F12 2.4 מ"ל DMSO ההרכב הסופי של המדיום cryopreservation הוא 65% DMEM/F12, KSR 25% ו 10% DMSO. Cryopreserving iPSCs טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש. טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק 'for15 ° C אמבט מים. עיין 1below טבלה לקבל פרטים על אמצעי האחסון הנדרש. לשאוב את המדיום בילה מספינת תרבות באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים פעמיים עם D-PBS. בעדינות להוסיף מראש חימם פתרון Dispase לכלי השיט תרבות (למשל, 1 מ"ל של תמיסת Dispase לכל צלחת 60 מ"מ תרבות). מערבולת כלי התרבות כדי לצפות את פני התא כולו. דגירה כלי התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הסר את כלי מן האינקובטור, לשאוב את הפתרון Dispase, לשטוף בעדינות את התאים עם D-PBS. בעדינות לגרד את התאים את פני השטח של צלחת התרבות באמצעות מגרד התא, ולהעביר את התאים צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל. יש לשטוף את המנה תרבות פעמיים עם KSR-FF, בעדינות "ריסוס את" כל התאים לא מנותקת. בריכת בינוני לשטוף עם התאים בצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה התחתית XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה וזורקים אותו. הכינו כמות מספקת של cryovials. ברגע שהתאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות. קפיצי בעדינות את הצינור, באופן מלא לעקור את התא גלולה מתחתית הצינור מחדש להשעות את התאים א בינוני מקפיא [על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה באמצעות 5 מ"ל סרולוגיות פיפטה]. בעקבות השעיה אחיד של גושים, מוסיפים נפח שווה של B בינוני מקפיא אליו, בצורה טיפה חכם, בעוד בעדינות מתערבל ההשעיה תא לערבב. הערה: בשלב זה, התאים נמצאים בקשר עם DMSO, עבודה חייב להתבצע ביעילות. לאחר התאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות. Aliquot 1 מ"ל של השעיה על התא cryovial כל אחד. במהירות למקום בקבוקונים ב פרוסטי מר [במהירות להקפיא] ולהעביר אותו -80 מעלות למשך הלילה. לאחר אחסון ולינה -80 ° C, להעביר את התאים מיכל חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך. iPSC להפשיר בקבוקון והתאוששות תא הערה: KSR-FF עשוי להיות מוחלף עם המדיום MEF ממוזג KSR המכילים, או בינוני KSR לשימוש עם המאכיל. ראו נספח הוראות להכנת אמצעי התקשורת. טרום חמים 10 מ"ל של מדיום KSR-FF בתוך שפופרת 50 מ"ל. לאזן את הכמות המתאימה של Geltrex מצופה הכלים בטמפרטורת החדר לשאוב כל נוזל הכלים לפני ציפוי אותךr תאים. הסר בזהירות את hESC (או iPSC) בקבוקון מטנק חנקן נוזלי אחסון. בקבוקון קפוא להפשיר במהירות של תאים אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים, רק עד נתח קפוא קטן נשאר הבקבוקון. תרסיס בקבוקון עם 70% isopropanol כדי לטהר אותו ולהעביר אותו את מכסה המנוע רקמה סטרילית תרבות. בסביבה נקייה מחיידקים, להעביר את כל תכולת הבקבוקון לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל בעזרת פיפטה 5 מ"ל. יש לשטוף את הבקבוקון עם 1 מ"ל של KSR-FF ולהוסיף את זה צינור 15 צנטריפוגות מ"ל. לאט לאט, להוסיף 4 מ"ל של KSR-FF נפתח חכם התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. בעוד הוספת בינוני, בעדינות להזיז את הצינור הלוך ושוב לערבב את התאים. (פעולה זו מפחיתה את הלם אוסמוטי על התאים). צנטריפוגה שפופרת 15 מ"ל עם ההשעיה התא 1000rpm (200 x ז) ​​למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant מבלי להפריע לתא גלולה. Re-להשעות את התא גלולה מראש חימם KSR-FF (למשל 4mL/60 צלחת מ"מ) בעזרת פיפטה 5 מ"ל פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה עד התא גלולה מפוזרת באופן מלא. הכדאיות של יותר מ 70% צפויה, אולם אם הכדאיות הוא פחות מ -70%, זה עלול לקחת זמן רב יותר עבור התאים להגיע למפגש. בעזרת פיפטה אותו, להעביר את ההשעיה תא נפתח חכם צלחת Geltrex מצופה תרבות טרום equilibrated לטמפרטורת החדר. מניחים את צלחת תרבות 37 ° C חממה, עם אווירה humidified של CO 4-6% 2 באוויר. בזהירות מערבולת כלי בצפון לדרום, ממזרח למערב דפוס כדי לפזר באופן שווה את התאים. בעדינות נוזל לשנות את המנה תרבות 24 שעות לאחר ההפשרה ואת יום לאחר מכן להסיר את פסולת התא כדי לספק מזון טרי עד המנה הוא כ 70-80% ומחוברות. עבור התרבות המשך passaging של תאים iPS שלך, עיין בפרוטוקול שלנו תחת הכותרת "מזין ללא התרבות Passaging של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני" תוצאות צפויות התאים צריכים להיות בערך 70-80% ומחוברות לפני cryopreservation. Dispase תוצאות עיכול להתכרבל מתקפלים המושבות בשולי המושבה. לאחר קצירת התאים הם קפואים כמו גושים קטנים בתקשורת cryopreservation. לאחר הבקבוקון הוא מופשר, תאים להתאושש לצרף צלחת מצופה מראש כמו גושים קטנים. הם גדלים במהירות המוביל צלחת ומחוברות בתוך 5-6 ימים. לוח 1 – כרכים מומלצים רכיב 35mm דיש 60mm דיש 100mm דיש השלם בנוקאאוט SR בינוני 2 מ"ל 4 מ"ל 10 מ"ל Geltrex פתרון 1 מ"ל 1.5 מ"ל 4-5 מ"ל Dispase 0.5 מ"ל 1 מ"ל 3-4 מ"ל D-PBS עבור שטיפה 2 מ"ל 4 מ"ל 10 מ"ל אנא לחץ כאן כדי לראות את התוספתן .