Bereiding van zeer Gekoppeld Rat Hart Mitochondriën

Introductie Mitochondriën van de rat hart is een van de meest voorkomende voorbereidingen voor het verleden en de huidige studies van cellulaire metabolisme. Ze kunnen snel en betrouwbaar worden verkregen in grote hoeveelheden uit wild type of knock-out dieren. De algemene procedure bestaat uit weefsel spijsvertering door trypsine, fractionering en differentieel centrifugeren. Er zijn verschillende voorwaarden waaraan moet worden gehouden tijdens de Isolatie van mitochondriën uit verschillende weefsels, waaronder het hart (afb. 1). Het weefsel moet grondig worden gehakt, omdat het rechtstreeks van invloed op de opbrengst van de verkregen mitochondriën. Hartweefsel is het beste te blad voor de mond met kleine gebogen schaar en kan gevolgd worden door gebruik van een slijpmachine Latapie tissue of, indien een weefsel slijpmachine niet beschikbaar is, een knoflook pers met afvoer gaten met een diameter van ongeveer 1,0 mm diameter. Het is noodzakelijk om de temperatuur van oplossingen te houden bij elke stap. Daarom is de hele procedure moet worden uitgevoerd in een koude kamer en alle instrumenten en oplossingen moeten worden opgesteld en gekoeld op voorhand. Als de temperatuur niet stabiel verschillende eigenschappen van het preparaat kan worden verloren. Mitochondriale structuur is erg gevoelig voor bevriezing, zodat overfreezing van de ophanging (bijvoorbeeld tijdens het centrifugeren) is niet toegestaan, zeker als studies van actief transport zijn belangrijk. Een belangrijke parameter is de tijd-duur van de procedure, de isolatie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd en de verkregen voorbereiding moet onmiddellijk worden gebruikt. Daarom, chirurgische instrumenten, oplossingen en apparaten moeten worden voorbereid op voorhand. Materialen en instrumenten Instrumenten Rechte operationele schaar, scherpe punt Gebogen schaar Pincet Petrischaal Kleine trechter + stuk nylon filter (voorwas) 6 bekers 50 ml Twee magnetische roerders en twee baden ijs Een grote ijsbad 2 kleine magneetstaven Spatels voor pellet schrapen Centrifugebuisjes Latapie weefsel drukt u op (kan worden vervangen met knoflook pers) Teflon-glas homogenisatoren 20 ml en 1-2ml Afval beker Eppendorf buisjes voor de laatste mitochondriale schorsing en monsters voor eiwitbepaling Ijs baden Oplossingen (berekend per 2 ratten): Wasbuffer: 0,3 M sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) Isolatie buffer: 0,3 M sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma A6003) (100 ml bereid uit de wasmachine buffer). Bovine serum albumine kan worden vervangen door minder dure vetzuur-vrij analogen. Dezelfde buffer of een isotone variaties kan worden gebruikt als buffer mengen. Trypsine (Sigma T8003) oplossing: 2.5mg/ml in 1 mM HCl (0,5 ml) Trypsine-remmer van soja bonen (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml Isolatie buffer Protocol De algemene opzet van de procedure wordt getoond op Fig. 1. Hearts moet worden gekoeld en gewassen in Wassen buffer, ventriculaire weefsel weggesneden, gehakt en gehomogeniseerd tijdens de fotolytische de behandeling met trypsine. De suspensie wordt gecentrifugeerd op lage snelheid en de verkregen supernatant wordt opnieuw gecentrifugeerd bij een hogere snelheid te verzamelen mitochondriën. Afhankelijk van de geplande experimenten de resuspenderen buffer kan worden vervangen door een andere isotone oplossing. Dieren werden beëindigd in overeenstemming met het Verenigd Koninkrijk "Dieren (wetenschappelijke procedures) wet." door cervicale dislocatie, gevolgd door onthoofding. Het is noodzakelijk om het hart extract onmiddellijk na onthoofding van het dier, zodat er geen vertraging tussen dier beëindiging en hart extractie. Als parallel isolatie van de lever mitochondriën wordt verwacht dat de ratten 's nachts moet worden gevast voorafgaand aan het experiment. Bereid drie bekerglazen met 40 ml wasbuffer. Koel ze in het ijs-zoutbad voor 3 tot 5 minuten voordat u verder gaat met de volgende stap. Zorg ervoor dat ze niet te overfreeze en direct net na wolken van ijskristallen beginnen te verschijnen te gebruiken. Open de thorax van de onthoofde rat en extract het hart. Maak kleine incisies en direct daarna het hart naar de ijskoude oplossing in de eerste beker. Knijp het hart om bloed te verwijderen en zet het in de tweede beker. Herhaal deze handeling voor elk hart. Droog de harten op het filtreerpapier. Verwijder alle vet, geronnen bloed, boezems en fasciae en het zwembad van het ventriculaire weefsel. Hak de gepoolde weefsel met kleine gebogen schaar op de petrischaal op ijs voor ongeveer 5 minuten tot de grootte van de deeltjes is ongeveer 1-2 mm. Doe het gehakt weefsel in het weefsel pers en passerenhet door. Wees ervan bewust dat een aanzienlijke hoeveelheid van het materiaal kan blijven in de pers, zodat al het hartweefsel te halen bij de wanden en de bodem van de pers. Overdracht van het materiaal in het bekerglas met 50 ml wasbuffer en roer. Filteren dan de suspensie door middel van een nylon filter. Was het gehakt weefsel op het filter 3 keer met de wasbuffer en gooi het filtraat. Breng de gewassen weefsel in 20 ml wasbuffer en plaats deze in het ijsbad op de magneetroerder. Voeg 0,5 ml trypsine-oplossing onder voortdurend roeren en start de timer. Bereid een andere magneetroerder, ijsbad en een tweede 50 ml beker. Op de 4 e minuut kort homogeniseren van de schorsing gedeelte met behulp van een klein gedeelte los gemonteerd glas-Teflon homogenisator (10-15ml) met een aantal op en neer slagen om de schorsing te verspreiden. Na homogenisering overdracht van de suspensie in de tweede beker. Herhaal de procedure op de 9 e minuut, zodat u de homogenisering van de schorsing twee keer uit te voeren in totaal. Na 15 min incubatie, voeg 10 ml van het isoleren van buffer met trypsine-remmer en incubeer gedurende 1 minuut. Nogmaals filteren de suspensie door een nylon filter en sla het filtraat. Verzamel de fractie deeltjes links op een filter en homogeniseren gedurende 1 minuut in 15-20 ml wasbuffer. Combineer de homogenaat met het filtraat en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 600g. Voorzichtig filter de resulterende supernatant in een nieuwe centrifugebuis. Voorkom besmetting door de pellet en centrifuge opnieuw gedurende 15 minuten bij 8500g. Na de hoge snelheid centrifugeren Verwijder het supernatant en spoel de pellet 2-3 keer met 1 ml van de buffer het teruggooien van het pluizige witte buitenrand laag. Breek de pellet met de spatel, maar vermijd de rode vlek van erytrocyten aan de onderkant. Als de bloedcellen kreeg Loos, verwijder de rode stukjes van de schorsing voor de homogenisering. Resuspendeer de pellet met een kleine homogenisator of anders door zachte pipetteren. Verdunnen de suspensie met meer Isolationbuffer en centrifugeer weer gedurende 15 minuten bij 8500g. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in mengen Buffer (een isotone buffer naar keuze) en centrifugeer opnieuw. De resulterende bruine pellet bevat gewassen intact mitochondriën. Resuspendeer de pellet in een zeer kleine hoeveelheid isotone buffer van uw keuze. Figuur 1. Schema het aantonen van de procedure stap voor stap het isolement van de rat hart mitochondriën. Bovenste gedeelte, Podia 1-9: weefsel verstoring, trypsine behandeling en homogenisering, onderste deel, podia 10-15: differentieel centrifugeren.