Оценка Цены Вирус Производство в водных системах

1. Ультрафильтрация морской воды для генерации "вирусов" Вода (Wilhelm & Poorvin 2001) Примерно 20L морской воды / lakewater собирают в виде стерильных насколько это возможно. Вода серийно prefiltered через 142-мм поликарбоната 0,8 мкм фильтры, которые могут храниться при температуре -20 ° С для сообщества анализа. Фильтры большего размера пор могут быть использованы, прежде чем этот шаг для очень производительных систем. Для получения ультрафильтрации воды из системы Amicon M12 (Millipore) 30 кДа-обрезания спираль используется картридж, чтобы исключить все вирусы, даже небольшие РНК-содержащих вирусов. Образцы обрабатываются и концентрируется на ~ 25% скорости ~ 15-16 кПа противодавления. Остальные образца ~ 500 мл воды будет содержать сосредоточены сообщество вирусов (которые могут быть сохранены для других экспериментов), а остальные 19,5 л вирусов вода будет использоваться для вирусных анализов производства. После каждого дня использования, Amicon M12 система должна быть очищена, чтобы предотвратить повреждение мембраны фильтра. Если вы работаете с морской водой, промыть мембраны с по крайней мере 6L Милли-Q водой с последующим промыванием 0,1 N NaOH раствор на 30-45 минут. Снова промойте картридж, по крайней мере 6L Милли-Q воды. При завершении работы с M12 системы, спираль картридж должен храниться в 0.05MH 3 PO 4 решения при 4 ° C. 2. Вирус методе редукции для вирусного производства (Wilhelm и соавт. 2002) До 500 мл морской воды / lakewater образца с хозяина и вирусы получается и помещен в блок sterifilter с 0,2-мкм номинальная пор по размерам низким белком-связывающий фильтра (например, Durapore), размещенные на нем. Образец мягко вакуум давление на <200 мм рт.ст. в то время как постоянно суспендирования образца с помощью стерильной пипетки передачи для подавления бактериальных клеток сосредоточиться на фильтре. Медленно три тома ультрафильтрата добавляются в бактериальной суспензии значительно сократить количество свободных вирусов в исследуемом образце. Бактериальная фракция разбавляют обратно до 500 мл с вирусом без воды и разделить на три повторов 150 мл каждая и находятся в открытом 250мл бутылки из поликарбоната. 3. Тангенциального потока фильтрации (TFF) Метод Вирусный Производство (Weinbauer и соавт. 2002, Winget и соавт. 2005) TFF представляет альтернативный подход к вирусным методом сокращения. Около 500 мл природном образце собирается, как описано выше. Этот образец концентрированного использованием 0,2-мкм номинальная пор по размерам тангенциальной системой фильтрации потока. При бактериальных фракция снижается примерно до 10-15 мл, ультрафильтрации, вирусов, добавляют воду и распространяется как указано выше. Повторить бутылки инкубируют при на месте условий с использованием температурных камер. Свет уровни изменяются условия на поверхности с помощью синего оттенка акрила или прозрачного акрила с экранированием сети, чтобы уменьшить интенсивность света. Температура окружающей среды поверхности часто получают с помощью морской воды течет палубе инкубатора. Образцы для бактериальных и вирусных оценки обилия берутся в момент времени 0 с конечной концентрации 2,0-2,5% стерильного глутаральдегида добавлены в криопробирки. Эти образцы сразу же глубокой заморозки жидким азотом и хранят в замороженном виде, пока обрабатываются. Если жидкий азот недоступен, микроскопия слайды могут быть подготовлены и обработаны немедленно (см. процедуру ниже) Подвыборки собираются каждые 2,5 часа, по крайней мере 10 часов по методике, описанной выше. В это время вода может быть собрана для количественного анализа ПЦР. До 5 мл образца могут быть добавлены к криопробирку без каких-закрепителя, с немедленным замораживания вспышки в жидком азоте. 4. Вирусный микроскопии Производство (Noble & Фурман 1998, Вэнь соавт. 2004) Замороженные образцы должны быть 0.02-мкм фильтром для микроскопии должна быть талой на льду. Подготовка исходного раствора SYBR Green путем разбавления 1:10 маточного раствора стерильной водой. Далее, из маточного раствора, готовят рабочий раствор, добавляя 1 мл исходного раствора до 39 мл стерильной воды. 50% глицерина, 50% фосфатного буфера солевых растворов (PBS, 0,05 М Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, рН 7,5) и свежие 2,5% маточного раствора р-фенилендиамин также должны быть подготовлены до начала. Держите 50% glycerol/50% PBS растворе при 4 ° С и р-phenylenediamINE акции при температуре -20 ° С в темноте до запуска. Прямо перед фильтрации добавить р-фенилендиамин на 50% glycerol/50% PBS до конечной концентрации 0,1% для использования в качестве Antifade решение. Место 25 мм 0.02-мкм Anodisc фильтр в верхней части 0,45-мкм MicronStep, целлюлозный фильтр поддержку. Добавить 850 мкл установленного образца в начало Anodisc и вакууме при 20 рКа до полного высыхания. Разместить 100 мкл SYBR Green рабочего раствора в стерильную чашку Петри и, с вакуумным еще включен, осторожно удалите Anodisc из фильтра башни и разместить на SYBR Green. Инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. Осторожно выньте фильтр из раствора SYBR зеленый и фитиль задней фильтр с Kimwipe чтобы удалить остатки красителя. При желании, вернуть фильтр башню и пройти до 800 мкл 0.02-мкм фильтрованной воды или стерильной СМИ через фильтр, чтобы смыть избыток пятно. Добавить небольшую каплю antifade решение стекло микроскопа и место покровное стекло сверху. Снимите крышку скольжения и добавить сушеный фильтр стекло микроскопа мокрым antifade решение. Опять же, добавить небольшое количество antifade решение покровным стеклом и медленно поместите его в верхней части фильтра, убедившись в том, чтобы избавиться от любых пузырей, которые могут образовывать. Сразу же заморозить слайды при температуре -20 ° С до необходимой (это должно быть использовано в течение нескольких месяцев, чтобы предотвратить выцветание и опустил вирус отсчетов) Вирусы перечисляются с помощью флуоресцентной микроскопии (в нашем случае микроскоп Leica DMRXA) с широкой голубой набор фильтров (λ = Ex 450 до 490 нм, λ Em = 510 нм с фильтром подавления при λ = 510 нм). Каждый фильтр будет иметь не менее 20 полей зрения считается, убедившись, что количественно общего вирусов из каждого поля сетки для обеспечения равномерного распространения вирусов через мембранный фильтр. Усредненные ставки вируса повторения из трех независимых повторяет, затем рассчитывается и стандартное отклонение определяется из норм выработки. 5. Представитель Результаты Сырых данных, собранных исследователем требует минимальной математической обработке для получения повторного темпами вирус изобилии. Первичного набора данных в результате данного исследования является повторение темпами вирус изобилии в подвыборки из инкубации. Эти результаты образуют самостоятельные регрессии вируса изобилии в зависимости от времени для каждого из образцов. Для каждого образца отдельных инкубации выступать в качестве одного лечения, поэтому, выполнив три одинаковых-инкубации исследователь может рассчитать ставки, а также оценка изменения (например, стандартное отклонение) (см. Рисунок 1). Одно предостережение этого процесса является то, что сокращение вирус неизменным изобилие приводит к сокращению клеток хозяина в образце, что являются носителями вируса бремя. Чтобы компенсировать эту потерю, перечисление бактериальных изобилии от обоих источников (нефильтрованного морской или озерной воды) и Т = 0 инкубации образца необходимо. Эта информация может быть использована для учета процент клеток теряется: если предположить, что процесс сокращения вирус изобилие не является избирательным за или против любого членов микробного сообщества, этот фактор может быть использован для оценки на месте дебит вирусов . Рисунок 1. Производство вирус-подобных частиц в течение 10 часов инкубации при температуре на месте условий с использованием epifluorescence микроскопии. Образцы были собраны во время цветения фитопланктона у берегов Новой Зеландии в сентябре 2008 года. Рисунок 2. Принципиальная схема процесса работы потока для опробования вирус производства. Процесс начинается с ультрафильтрации пробы воды для генерации вирусов воды. Это завершены использованием ультрафильтрации системы. Параллельно проб воды собираются в том же месте и бесплатный вирусов пропускают через фильтр в то время как микробного сообщества (содержащий смесь зараженных и незараженных клеток) сохраняется. Это сообщество затем ресуспендировали в воде вирусов и инкубировали при на месте условий. Повторения скорость вирусов является то контролироваться на ближайшие 10 часа для определения ставок вируса производства.