Estratégias para Estudo da neuroproteção de frio pré-condicionamento

Técnicas estéreis e assepsia são fundamentais para a preparação, manutenção e uso de culturas fatia por períodos prolongados. Além disso, a justificativa para o uso de culturas fatia somente após 18 dias in vitro é baseada na evidência que indica excitatórios e inibitórios transmissão sináptica torna-se mais maduro, e glia (astrócitos e microglia) tornam-se quiescentes e consistente com os seus homólogos em vivo (Figura 1 ). 1. Preparação e manutenção das Culturas Slice Hippocampal Mesmo dia da cultura, equilibrar insere estéril em 1,1 media mL de crescimento composto de 50 mL Basal Medium Eagle, 25 mL de Earle solução salina balanceada, 23 mL soro de cavalo, 0,5 mL Glutamax (200 ações mM), 0,1 mL de gentamicina (10 mg / mL de ações), 0,4 mL Fungizone (250 mcg / mL), 1,45 mL D-glicose (45%; 42 total mM). Mantenha seis bandejas bem em uma incubadora a 36 ° C, o dióxido de carbono de 5% e 95% de umidade. Para esterilidade máxima, cultivo deve ser feito preferencialmente em uma sala de cultura filtrado HEPA com pressão positiva com o ar também purificado via auto-suficiente luz ultra-violeta limpeza de ar-fãs, e enquanto usava um jaleco limpo e luvas estéreis esticada sobre as mangas jaleco . Prepare culturas fatia em uma capa de NBS-1 laminar fumos que inclui todos os materiais necessários (ie, McIlwain helicóptero tecido, inserções relacionadas com Teflon, lâmina de barbear corte, dissecção fria (3-4 ° C placa pratos), instrumentos cirúrgicos, e dissecção Petri) usando um microscópio estereoscópico (M8) Wild. Permitir que a placa de refrigeração (executado a partir de um banho de água nas proximidades) para chegar a 3-4 ° C de temperatura por pelo menos 30 min, enquanto, ao mesmo tempo expondo materiais dissecção à luz ultravioleta para consolidar ainda mais a esterilidade da área de dissecção e ferramentas. A capela de fluxo laminar é periodicamente testado para garantir a luz ultravioleta tem energia suficiente ao nível de mesa com um medidor de medição de ondas curtas de luz ultravioleta. Use filhotes de ratos (P8-P9 e ~ 23 g / ea. Abatidos de ninhadas a 10 no nascimento) anestesiados com dióxido de carbono a 100% em uma caixa de pequenos animais em um banco de assepsia por trás da fumaça capô e limpos por imersão em etanol 100% dentro a capela, onde todas as etapas subseqüentes são realizadas. Decapitar filhotes em uma metade de um prato de 100 milímetros de Petri e colocar a cabeça no segundo semestre, usando um prato fresco por filhote. Dissecar o cérebro e colocá-lo na metade inferior de uma placa de Petri 60 milímetros contendo 10 mL estéril fria (3-4 ° C) solução salina balanceada de Gey suplementado com D-glicose a 6,5 ​​mg / mL (ou seja, 7,5 mL de 45 % d-glicose por 500 mL de Gey é. Dissecar o hipocampo de cada hemisfério e colocá-los em um disco de Teflon para o helicóptero McIlwain. Mídia espalhou longe do tecido cerebral usando uma espátula de íris para evitar seções cérebro corte de aderir à lâmina de corte. Seção perpendicular aos seus hipocampos longo eixo usando o helicóptero McIlwain, com espessura de corte fixada em 350-400 mM. Vivamente lavar recém-cortado fatias fora das pastilhas de Teflon e na metade superior de uma placa de Petri contendo 60 milímetros fria (3-4 ° C) Solução de Gey salina balanceada com 6,5 mg / mL D-glicose usando uma pipeta uma mL. Inspecionar as fatias sob o estereomicroscópio para um giro denteado intacta e camada de células piramidais. Delicadamente, coloque as maiores fatias para uma inserção (três por inserir e 12 fatias / filhote) e manter em condições normais de incubação em uma incubadora limpa a cada seis meses e calibrada a cada três meses com um analisador infravermelho de dióxido de carbono e termômetro de precisão, com uma casa decimal. Meios de crescimento em placas de cultura de atualização a cada 3-4 dias in vitro usando um capuz BSL-2 e técnica estéril. Após 7 dias in vitro, substituir a mídia com 1,1 mL de soro livre de media (SFM), constituído de 97 mL Neurobasal, 2 mL B27, 0,5 mL Glutamax (200 mM), 0,1 mL de ácido ascórbico (0,5 M), e 0,68 mL D- glicose (45%; 42 total mM). 2. Pré-screen vitalidade das culturas Slice Alíquota Sytox Verde estoque (10 mL) e armazenar a -20 ° C. Diluir ações a 500 nM Sytox trabalhando concentração nos meios de comunicação sem soro de crescimento (ou seja, 10 mL em 100 mL de mídia). Loja Sytox media a 4 ° C e usar por até uma semana. Lugar mL 1.1 do Sytox por bem em pratos de 6-cultura e bem quente a 36 ° C no dióxido de carbono de 5% por um período suficiente (isto é, como evidenciado pela falta de condensado em placas de cultura). Enquanto isso, permitir que uma lâmpada ultravioleta (ie, uma fonte de luz fluorescente com um filtro FITC) alimentado através de uma fonte de alimentação estabilizada para garantir a intensidade de luz uniforme para aquecer a temperatura de pelo menos 20 min. Lugar culturas fatia (18 diass in vitro) em Sytox-media por 10 min e depois voltar para SFM para triagem de irreversível lesão camada CA1 piramidal. Ver culturas em uma superfície asséptica de um microscópio invertido, examinados sob ampliação de 5x. Aceitar culturas com menos de 30 Sytox células positivas na área CA1. 3. Frio Precondicionamento Lugar mL 1.1 do SFM em pratos bem 6-cultura. A mídia resfriado (por exemplo, 30 ° C) para equilibrar em um (dióxido de carbono de 5% e 95% de umidade) incubadora de pelo menos 20 min antes do uso. Ausência de condensação em placas de cultura indica que o tempo adequado para equilíbrio ocorreu. Transferência insere cultura fatia media refrigerado (1,1 mL / poço) bandeja mantida a 30 ° C e incubar por 90 min usando técnica estéril em uma capa BSL-2 de fumos. Lugar culturas fatia de volta para SFM normais sob condições normais de incubação por 24 horas, novamente usando técnica estéril através de uma capa BSL-2 de fumos. 4. Lesão excitotóxico Começar a fatia cultura prescreen uso experimental, expondo à mídia Sytox por 20 min. Adquirir imagens fatia individual com fatias mantida em uma orientação semelhante à utilizada para prescreen (imagens de fundo). Isto é feito colocando uma marca para a esquerda e duas marcas para a direita com a caneta "10" e "dois" horas em cada inserção. Esta manobra facilita o uso da mesma área de forma de juros para cada cultura conjunto de imagens. Ao mesmo tempo, ligue a fonte de luz ultravioleta (com fonte de alimentação regulada), e CCD da câmera para um mínimo de 20 min para que à temperatura. Então, calibre a câmera CCD com uma padrão fluoroscein. "Limpar" o CCD, expondo à luz por 50 ciclos a menos que uma calibrar automaticamente câmera CCD é usado. Nós estabelecemos um programa dentro Metamorph para limpar nossa câmera snap fresco usado para a quantificação de lesões. ML colocar 10 de fluoroscein em 90 mL de PBS (tampão fosfato 10 mM, 150 mM de NaCl a 7,3 pH) e vortex. Pipetar 10 mL da mistura fluoroscein em um hemocitômetro M 100 de profundidade. Ajustar a intensidade da imagem completa para 1000/4096. Coletar imagens de fundo de culturas fatia para verificar se a frio pré-condicionamento não causar lesões (ou seja, descartar culturas com ≥ 250 CA1 área de intensidade de juros). Prepare as bandejas com media NMDA. Prepare solução estoque 10 mM de NMDA pelo menos semanalmente. Por danos excitotoxic, diluir a 20 NMDA 50 mM em SFM e equilibrar as condições de incubação normais durante pelo menos 20 min. Usando a capa BSL-2 e técnica estéril, insere lugar no NMDA-media por 60 min de incubação em condições normais. Enxágüe NMDA off de inserções por imersão cada inserir três vezes em três separados 60 pratos mm cada Neurobasal mL contendo 10 aquecida a 36 ° C. Não use mais de três inserções para cada conjunto de três pratos de lavagem de 60 mm. Retorno culturas às condições de incubação normal. Coletar imagens ferimentos 24 horas após a exposição ao NMDA. Calibrar câmera com fluoroscein padrão como descrito acima. Culturas lugar na mídia Sytox por 20 min. Quantificar lesão: Usando software Metamorph, desenhe uma AOI torno CA1 região. Intensidade medida da região selecionada para "lesão". Copie e cole AOI de "lesão" ao "background" da imagem. Digite os valores de "lesão" e "background" para o Excel. Quantificar "numerador-fundo" para o Controle e Cold-preconditioned culturas. Usando o software de estatística (por exemplo, SigmaStat), executar os testes estatísticos apropriados para comparar lesão do grupo experimental (s) versus um grupo controle, que deve ser sempre incluído com cada corrida experimental. Nota: Se os níveis de lesão é baixo em um dia pós-lesão imagens, carry-out experimento para dois, três dias. Proteção das culturas podem ser mascaradas devido à falta de susceptibilidade à lesão (Figura 2). Nota: A questão da "proteção" nos levou a mover-se para medir níveis de lesão e não razões para todas as comparações (Figura 3). 5. Co-tratamentos aplicados com frio pré-condicionamento Uma vantagem importante das culturas fatia é que a condição ambientals pode ser controlada com precisão. Isto significa que a sinalização de citocinas de frio pré-condicionamento pode ser medido, imitou, e modulados para dissecar os aspectos nó crítico. Recombinante (eg, agonista) e neutralizando proteínas (por exemplo, anticorpo ou receptor solúvel) proteínas pode ser usado para imitar e modular, respectivamente, de sinalização de citocinas. Em geral, essas proteínas são reconstituídos e armazenados como alíquotas a -20 ° C para uso dentro de seis meses para garantir a bioatividade adequada. Aqui, descrevemos o uso exemplar de TNF-α revogação sinalização usando receptor TNF solúvel 1 (sTNFR1). Reconstituir sTNFR1 em 0,1% de soro albumina bovina em PBS a um estoque de 50 mg / mL, da alíquota em 20-50 quantidades mL, e armazenar a -20 ° C. Para uso, diluir sTNFR1 a 200 ng / mL nos meios de comunicação fatia culturas crescimento aquecido a 36 ° C e culturas lugar fatia em sTNFR1-media por 20 min antes do frio pré-condicionamento. Nota: Para reduzir a variância, o melhor é diluir 200 ng / mL sTNFR1 em um grande volume de meio de crescimento (ou seja, diluição 1:250 de 50 mcg / mL sTNFR1 estoque em 10 mL de meio de crescimento necessita de 40 mL sTNFR1) vs acrescentando sTNFR1 diretamente a cada poço no prato (4,4 mL por 1,1 mL de mídia). Diluir sTNFR1 a 200 ng / mL nos meios de comunicação e colocar 1,1 mL em cada inserção bem. A mídia para equilibrar a 30 ° C durante pelo menos 20 min antes de expor culturas fatia para a frio pré-condicionamento por 90 min, como descrito acima. Lugar culturas fatia de volta a 36 ° C com sTNFR1 presente na mídia. 24 horas depois, expor culturas de Sytox media por 20 min, como descrito anteriormente e recolher imagens de fundo para verificar se a frio pré-condicionamento não ferir as culturas. Quantificar dados, como descrito acima. Atualizar mídia com componentes cada 3-4 dias in vitro. 6. Imediata e tardia ferimento excitotoxic após a frio pré-condicionamento Lesão imediata com frio pré-condicionamento. Realizar a frio pré-condicionamento, como descrito acima. Depois de frio pré-condicionamento, o retorno à incubação de culturas normais por 20 min. Então, expor culturas de 20-50 mM NMDA lesão durante uma hora. Enxágüe culturas três vezes como descrito acima e retornar à incubação normal. Após 24 horas, adquirir fotos lesão como descrito acima. Efeitos retardados de frio pré-condicionamento. Realizar a frio pré-condicionamento, como descrito acima. Expor culturas de lesão NMDA 24 horas mais tarde, como descrito acima. Continuar a adquirir imagens de lesões por até três dias após o inicial de pré-condicionamento frio para monitorar a proteção. 7. RNA Isolation Os procedimentos seguinte expressão de genes são escalados para uma cultura única fatia. Transferência de culturas fatia de meio de crescimento e incubação normal RNAlater 3 mL em 6 pratos bem-cultura para estabilizar RNA. Armazenar a 4 ° C por até três dias até ser transformado conforme descrito abaixo. Levante cuidadosamente a cultura fatia fora da pastilha com um pincel fino ponta pintar e colocar em 1 mL de frio (4 ° C) em um PBS 1,5 mL (DNase, RNase e DNA livre) tubo de microcentrífuga. Centrifugar amostras por 30 segundos e remova o sobrenadante PBS. Armazene as amostras à temperatura de -80 ° C. Para isolar RNA de culturas fatia (~ 250 ng / ea.), As amostras de descongelar em gelo. Isolar RNA usando kit Qiagen MicroRNeasy via os seguintes procedimentos que são descritos em mais detalhes e adaptado a partir do Micro RNeasy Handbook (Qiagen). Coloque 350 mL de buffer RLT (contendo 10 L β-mercaptoetanol por mL) em cada tubo de microcentrífuga contendo uma cultura fatia. Homogeneizar amostras em vortex por 30 seg. Triturar do tecido, se necessário (isto é, o tecido pellet ainda visível), utilizando um pilão descartáveis ​​até que esteja completamente homogeneizados em tampão RLT. Coloque 350 mL de etanol 70% na mistura lisado e pipetar para misturar. Transferência homogeneizado a uma coluna de rotação e coloque em um tubo de coleta (ambos coluna girar e tubo de coleta são fornecidos pela Qiagen). Centrífuga de amostra por 15 segundos em velocidade máxima. Manter a coluna. Lavar a coluna girar, adicionando 350 mL de buffer RW1 mais centrifugar por 15 segundos na velocidade max. Descartar buffer. Diluir 10 mL de DNase I de estoque em 70 mL de buffer RDD para produzir 80 mL de volume total. Pipeta suavemente para misturar não vortex. Prepare 80 mL de estoque DNase diluído por amostra. Incubar a temperatura ambiente por 30 min. Adicionar 350 mL de buffer RW1 a amostra coluna girar e centrifugar por 15 segundos. Descartar tubo de coleta. Usando um tubo de nova coleção, adicionar 500 mL de buffer RPE a amostra e centrifugar por 15 segundos e descartar buffer. Coloque 500 mL de etanol 80% da amostra e centrifugar por 2 min. Descartar o tubo de coleta. Seca as colunas giram por centrifugação por 5 min em velocidade máxima com tampas de tubo aberto, descartar tubos de coleta, e na coluna transferência de spin para um tubo de coleta de 1,5 mL fornecidos pelo kit. Para coletar RNA isolado, coloque 14 mL de água RNase-free no centro da membrana coluna spin. Centrifugar por um minuto e recolher o líquido. Adicione 2 mL de RNasin (diluído a 1 U / mL em tampão TE) e armazenar a -80 ° C. Tampão TE consiste em 10 mM Tris (tris [hidroximetil] aminometano), 1mM EDTA (ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico hidratado) em 8,0 pH. 8. Quantificação de RNA Nota: RNasin não interferem com o ensaio RiboGreen. Diluir 1:200 em RiboGreen RNase tampão TE como se segue. TE (mL): 1; Ribogreen (mL): 5; TE (mL): 4; Ribogreen (mL): 20; TE (mL): 6; Ribogreen (mL): 30. Padrões de RNA são preparadas como se segue. TRNA levedura é usado como o padrão RNA. tRNA é armazenado (-20 ° C) como 1 mg / mL em tampão TE. Diluir a 1 mg / ml de caldo de 1:100 em tampão TE, usando (DNase, RNase e DNA livre) 1,5 mL tubos de microcentrífuga para produzir um padrão de 1 mg / mL de trabalho. Preparar a curva padrão diretamente em uma placa de 96 poços do teste de fluorescência, adicionando o tampão TE diluente em primeiro lugar, em seguida, adicionando a quantidade adequada de um padrão mcg / mL para o buffer TE já nos poços da placa, como mostrado na tabela ao lado. Faça duplicar poços para cada padrão da seguinte maneira. Vol. de std. (ML): 100; Vol. de TE (mL): 0; RNA em bem (ng): 100; Vol. de std. (ML): 80; vol. de TE (mL): 20; RNA em bem (ng): 80; Vol. de std. (ML): 60; vol. de TE (mL): 40; RNA em bem (ng): 60; Vol. de std. (ML): 40; vol. de TE (mL): 60; RNA em bem (ng): 40; Vol. de std. (ML): 20; vol. de TE (mL): 80; RNA em bem (ng): 20; Vol. de std. (ML): 0; vol. de TE (mL): 0; RNA em bem (ng): 0. O ensaio é preparado como se segue. Adicionar 99 mL de tampão TE a cada um dos poços de amostras da placa de 96 poços. A maneira mais eficiente de fazer isso é usar uma pipeta multicanal. Adicionar 1 mL de RNA para os poços da amostra experimental. Adicionar 100 mL da RiboGreen diluído em cada cavidade utilizando o pipetador multicanal e triturar com um ou dois cursos do pipetador. Leia a placa em um leitor de placas fluorescentes a 480 nm de excitação e 520 nm de emissão. Construir uma curva padrão usando o Microsoft Excel com medida intensidades de fluorescência das RNA padrões. Calcular as concentrações de RNA em amostras usando a equação resultante linear a partir da curva padrão. 9. SYBR Green PCR quantitativa Procedimentos de PCR são melhor feito em uma área limpa reservados especificamente para trabalhar com RNA (Figura 4). Descontaminar a área e equipamentos de laboratório relacionados com a contaminação potencial de DNA e atividade RNase antes de usar com luz ultravioleta, lixívia 10% ou RNase Away. Usar luvas em todos os procedimentos. Use RNase água livre para todos os procedimentos que vêm com o kit. Não use DEPC-água (diethylpyrocarbonate) tratados. Fechar todos os tubos de PCR-relacionados imediatamente após o uso para retardar a contaminação de aerossóis de DNA estranho. Desenvolver e caracterizar primers para a meta de mRNA (s) de interesse. Estes métodos são descritas nos métodos complementares para Hulse et al. Journal of Neuroscience, 2008 13. cDNA é produzido 3-20 ng de RNA total por meio de transcrição reversa usando iScript. A escolha de iniciar a quantidade de RNA é determinado pela quantidade total de RNA disponíveis com o objetivo de realizar análise de RT-PCR em uma parte da amostra (ie, 10% -20% do total). A porção restante maiores de RNA é armazenado para futuras análises. O kit iScript utiliza uma mistura de hexâmeros aleatórios e oligo-dT primers, e uma transcriptase reversa modificada MMLV em um volume total de 20 mL. Reversa procede transcrição para 25 ° C por 30 min seguido por 42 ° C por 50 min, e da transcriptase reversa é posteriormente desnaturadas a 85 ° C por 5 min. Diluída em tampão TE cDNA para uma concentração final de 0,4 em relação ng / mL de iniciar quantidade de RNA. SYBR Green PCR estratégia baseada é usado para amplificar cDNA. As reações de PCR são monitorados em tempo real através do monitoramento incorporação SYBR Green. As 50 reações mL contêm 3 mM MgCl 2, 200 mM dNTPs, 15 pmol de primers cada frente e verso, 1 mM de fluoresceína, 1x SYBR Green corante, 10 L (4 ng) cultura fatia cDNA, e 1,25 U de polimerase Taq Platinum em reação tampão composta por 50 mM KCl e 10 mM Tris, pH 8,3. PCR é realizado usando o termociclador iCycler que pode coletar dados em tempo real. Parâmetros de ciclismo composto por 15 seg desnaturação (95 ° C), seguido por 30 segundos de recozimento extensão / (60 ° C) repetiu 45 vezes. Medições ópticas são tomadas durante a etapa de recozimento / extensão e valores Ct foram determinados utilizando o software do sistema iCycler. cDNA para alvos de citocinas de interesse e β-actina são usados ​​para construir curvas padrão. Número de cópias é determinado a partir do peso molecular e massa do cDNA plasmídeo. Curvas padrão de número de cópias / massa são construídos e incluídos em cada ensaio. Valores Ct para cada diluição de cDNA são usadas para determinar o número de cópias v. curva Ct. Citocinas e β-actina níveis de número de cópias são determinados para as amostras usando curvas padrão. 10. PCR quantitativo para Microarrays Quantitativa em tempo real triagem série qPCR é um meio altamente sensível e reprodutível para sonda de baixo nível mudanças expressão mediador inflamatório. O RT2 Profiler variedade de PCR é usado para SABiosciences mediador inflamatório mudanças de expressão gênica, com os seguintes passos descritos em mais detalhes pelo fabricante. O ensaio utiliza 0,1-1,0 mg RNA. Usamos áreas fatia local (por exemplo, que fornece CA1 ~ 250 ng de RNA total a partir de duas amostras combinadas) ou toda fatias individuais que contêm a mesma quantidade de RNA total. RNAs amostra e controle são reverso transcrito para cDNA usando um kit de primeira vertente (por exemplo, # C-03). O cDNA resultante é misturado com uma mistura de PCR SYBR Green-based (# PA-011) e 25 mL aliquotado em cada um dos 96 poços da placa de série PCR (medindo 84 genes únicos experimental e 16 genes housekeeping). Uma placa de matriz é preparada para a amostra experimental e um segundo prato é preparado para o controle. Nota: O SYBR master mix Verde fornecido pelo fabricante é cycler térmico específico. Ciclagem térmica é feito usando um iCycler com um protocolo de ciclo de 40 consistindo de uma etapa de desnaturação de 15 seg a 95 ° C seguido por uma etapa de extensão de um min a 60 ° C. Dados ópticos são coletados durante a etapa de extensão. Ciclagem térmica é seguido por análise da curva de derreter a digitalização da temperatura 55-95 ° Escala C em incrementos de 0,5 ° C. A expressão relativa de genes em placas tratados e controle foi determinada utilizando a 2 – método ΔΔCt usando o software fornecido com base Excel e expresso como um aumento ou diminuição vezes em relação aos controles. Genes com duas vezes aumenta ou diminui de expressão são considerados para avaliação. Genes identificados a partir de PCR screening array (por exemplo, usando # Parn-011A para a pré-condicionamento-frio) são ainda confirmed usando qPCR. Arrays PCR identificar quais genes são regulados em resposta a estímulos. No exemplo da pré-condicionamento frio, identificamos o gene IL-11 como positivamente regulada em resposta ao frio pré-condicionamento. O próximo passo na análise é confirmar que o gene recém identificado é regulamentada em culturas fatia utilizando o ensaio de qPCR detalhados acima. 11. Multiplexados Microesfera Fluxo Assay citometria Proteômica Expor culturas fatia para a frio pré-condicionamento, como descrito acima. Colheita culturas fatia para ensaio de proteína total. Levantar delicadamente corta a inserção usando um pincel de ponta fina e coloque em 1 mL frio (4 ° C) PBS. Centrifugar tubos e remover PBS off culturas fatia. Colocar em gelo seco até que a colheita é terminada. Tubos de armazenamento a -80 ° C. Homogeneizar amostras de cultura fatia para a realização de um ensaio de proteína total. Prepare tampão de lise celular para homogeneização. Seguindo as instruções do fabricante (Bio-Rad), adicione os inibidores da protease para 5 mL de tampão de lise e reserve no gelo. ML colocar 100 de tampão de lise em cultura de lâminas e rodelas de agitar pipetando cima e para baixo cinco vezes com uma ponteira de 100 L cortado a 1 mm. Agite amostras na placa shaker a 4 ° C por 20 min. Centrifugar as amostras a 13.000 rpm por 15 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo e reserve no gelo. Realizar ensaio de proteína total. Prepare BSA (albumina bovina) padrões de proteínas. Reconstituir estoque BSA com água ultrapura de acordo com instruções do fabricante. Elaborar normas de proteínas que vão 0000-1000 mcg / mL, diluído em tampão de lise. Calcular o volume de reagente de trabalho necessários, de acordo com as instruções do kit. Por exemplo, (oito normas + 18 amostras desconhecidas) x (duas repetições) x (200 mL de reagente de trabalho necessária por amostra) = 10,4 mL de volume total do reagente de trabalho necessário para carregar em uma microplaca de 96 poços (por exemplo, ensaio de citometria de fluxo microesfera , veja abaixo). Quando a mistura reagente A com B reagente, alguns turbidez pode ocorrer, mas devem desaparecer em breve. Carga de 10 L de padrões e amostras em microplaca. Load 0,2 mL de reagente de trabalho em poços. Cobertura de microplaca com fita adesiva e agitar na placa shaker durante 30 segundos. Incubar microplacas a 37 ° C por 30 min. Microplaca arrefecer à temperatura ambiente (cerca de 10 min) antes de ler em um leitor de placas a 595 nm. Construir uma curva padrão usando o Microsoft Excel com absorbâncias medidos de padrões BSA. Calcular as concentrações de proteínas em amostras usando a equação resultante linear a partir da curva padrão. Dilua todas as amostras para a menor concentração medido com tampão de lise e armazenar a -80 ° C. Realizar um único plex e tecido de citocinas multiplex (ou fluido) ensaios, conforme descrito em detalhe completo nas referências # 12 e 16. 12. Imuno-histoquímica Fix culturas por 24 horas com fixador PLP composta de 10 mL de paraformaldeído a 16%, 1,096 g de lisina, 0,42 g de fosfato de sódio, e 0,17 g periodato de sódio, cheio até um volume total de 80 mL com água ultrapura (fixador é de 6,2 pH). Nós achamos que PLP fixador é um fixador suave que permite a detecção de baixo nível imunocoloração que de outra forma não seria evidente utilizando fixadores outros. Culturas são fixos por 24 horas e depois transferidos com um pincel fino para PBS contendo azida de sódio (100 mg / L). Imunomarcação de campo claro de flutuar culturas fatia inteira é realizado da seguinte forma com todos os passos acoplado a agitação em ~ 50 rpm. Lavar culturas fatia em 3 mL PBS três vezes por 10 min. Extinguir culturas fatia em 0,3% H 2 O 2. Diluir 30% H 2 O 2 em solução estoque PBS. Lavar culturas fatia em PBS três vezes, 10 min cada. Bloco culturas fatia durante uma hora a temperatura ambiente em 3 ml de solução de bloqueio em uma placa de seis bem composta de 10 mL soro de cabra, 0,75 mL Triton X-100, e 89,25 mL PBS. Soro para a solução de bloqueio deve vir da mesma espécie em que o anticorpo secundário foi levantada. Incubar as culturas fatia durante a noite em anticorpo primário diluído em solução de bloqueio a 4 ° C. O volume máximo de solução de anticorpo primário para os pequenos de vidro Pyrex prato poços deve ser 0,3 mL volumes mais altos tendem a correr ao longo da borda do prato. Coloque o prato em um recipiente fechado umidificado. Nós não cobrir o prato com película aderente desde seções podem ser girado no filme sobrejacente e perdeu para o workup mais adicional. Ajustar velocidade de agitação placa shaker como grandes o suficiente para circular fatias na solução de anticorpos. Retire as fatias de placa de vidro e lavar em PBS por três vezes durante 10 min por lavagem. Incubar fatias em anticorpo secundário em temperatura ambiente por uma hora, agitando. Use pratos pequenos de vidro Pyrex para carregar 0,3 mL de solução anticorpo secundário. Lavar três vezes em PBS, 10 min por lavagem. Visualize coloração com 3'-diaminobenzidina (DAB). Dissolver 30 mg de DAB em 3 mL dimetil sulfóxido. DAB filtro usando dois # 1 papéis de filtro e lavar com 54 mL PBS. Imediatamente antes da utilização, adicionar 20 mL de 30% H 2 O 2. Incubar culturas em DAB solução para 5-7 min à temperatura ambiente. Nota: DAB é uma substância cancerígena e devem ser descartados de forma apropriada. Dispor de todas as soluções de DAB em um recipiente marcado armazenados em um exaustor, e colocar todos os pratos em solução de água sanitária para desativar DAB. Todas as soluções DAB deve finalmente ser descartados através do Gabinete de Segurança Institucional. Lavar culturas fatia em PBS três vezes para cada 10 min. Wet montagem culturas fatia de gelatina (ou silano) slides revestido com 100 mL detergente dissolvido em água destilada. Secar durante a noite à temperatura ambiente. Evitar o uso de aquecedores de slides calor excessivo pode causar rachaduras nas culturas montado slides. Desidratar slides através de uma série de etanol classificados (50, 75, 95, 95, 100, 100%) por 30 segundos cada. Slides claro com xileno quatro vezes por dez minutos cada. Usando um vidro Pasteur pipeta, coloque 0,1 mL de meios de montagem em cima da lâmina e lamínula com cuidado para evitar bolhas de ar formando. Secar durante a noite à temperatura ambiente. Imunomarcação fluorescente. Seção culturas fatia para 20 mm de espessura utilizando um criostato. Ajustar as configurações criostato a -16 ° C para temperatura interna, e -12 ° C para a temperatura do objeto. Coloque uma pequena quantidade de água em metal chuck utilizando uma pipeta Pasteur e congelar em gelo seco. Aplique uma camada fina de disco Tissue-Tek mídia em cima do chuck congelados. Permitir chuck para congelar e atingir a temperatura da câmara criostato. Seção Tissue Tek-media para criar uma superfície achatada adequado para a aplicação culturas fatia plana. Observe a orientação do chuck enquanto esta secção oferece um ângulo de corte consistente para que irá impedir meios de montagem de cair o mandril. Quando congelada, tome jogar fora e coloque em um suporte. Usando uma espátula de metal e uma multa de ponta de pincel, um slide sobre cultura fatia espátula e transferir para omeio da camada achatada de Tissue-Tek mídia sobre o mandril. Coloque uma camada fina de Tissue-Tek mídia sobre a cultura fatia montado e congelar a temperatura da câmara durante pelo menos 10 min. Com o botão "trim" ativado, seção as camadas superiores da Tissue Tek-media até que a cultura fatia é visível. Mudar de "trim" a "seção" preset em 20 mM. Pick-up 20 seções mM com gelatina revestido slides que são temperatura ambiente e slides secar durante a noite. Tissue Tek-media será visível em slides, mas dissolve-se em lavagens PBS. Imunocoloração. Lave as lâminas em PBS por três vezes durante 10 min cada. Saciar em 0,3% H 2 O 2 durante 15 min à temperatura ambiente, sob agitação. Lave as lâminas em PBS por três vezes durante 10 min cada. Usando SFX sinal enhancer, aplique algumas gotas de Componente A diretamente em cima de seções em lâmina e incubar por 30 min à temperatura ambiente em câmara úmida. A incubação com componente substitui o passo bloqueio com solução 10% de soro de cabra realizados em imuno-histoquímica de campo claro. Slides incubar em anticorpo primário diluído em 0,75% Triton X-100 em PBS por duas horas a 37 ° C. Aplicar a solução anticorpo primário directamente ao topo de slides e incubar em câmara úmida para evitar a evaporação. Não incluem soro em qualquer uma das soluções de anticorpos só usar PBS e Triton X-100. Lave as lâminas em PBS por três vezes durante 10 min cada. Incubar em anticorpo secundário por uma hora à temperatura ambiente e proteger slides da luz. Centrifugar todos os anticorpos fluorescentes secundário por 20 min para evitar qualquer agregados de ficar na solução de anticorpos. Preparar diluições do anticorpo usando 0,75% Triton X-100 em PBS. Lave as lâminas em PBS por três vezes durante 10 min cada. Dip slides vez em água destilada para lavar os sais de PBS. Slides secar durante a noite à temperatura ambiente, cobertas ao abrigo da luz. Lamela slides com prolongar o programa MEDIA Antifade. Componente descongelar no microondas por um sec 10/05 e adicionar cerca de 1 mL para um frasco de Componente B. Misture com uma pipeta Pastuer, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. Centrifugar por 5 min em velocidade máxima para remover as bolhas. Aplique uma camada fina de prolongar o programa MEDIA para o topo da lâmina utilizando uma pipeta Pastuer, cuidado para evitar a criação de bolhas de ar. Delicadamente, coloque lamínula em cima do slide e secar durante a noite, coberto ao abrigo da luz. Duplo-label imunocoloração fluorescente (Figura 5). Executar fluorescentes imunocoloração como descrito acima, exceto diluir tanto anticorpos primários na solução de incubação mesmo. Diluir todos os anticorpos secundários na mesma solução e incubar conforme descrito acima. Períodos de incubação serial usando dois anticorpos resultou em imunocoloração diminuída. 13. Resultados representante Figura 1. Aparecimento de culturas fatia do hipocampo e microglia. A imagem da esquerda mostra uma típica maduras (ou seja, 21 dias in vitro) cultura fatia hipocampal mancha com NeuN (verde) para ilustrar a citoarquitetura dos neurônios principal. Neurônios piramidais são mostrados em áreas CA1 e CA3 e dentcomeu giro (DG) neurônios para a esquerda. Barra de escala é de 250 mM. A imagem da direita é derivada da área CA1 e mostrado com maior poder para ilustrar a qualidade da microglia ramificada quiescentes dentro das culturas fatia maduro. As células foram marcadas com o marcador de superfície da microglia, CD11b. Barra de escala é 50 mm. Figura 2. Frio pré-condicionamento neuroproteção em culturas fatia do hipocampo. Culturas são incubadas com Sytox Green, um marcador de células fluorescentes marcados mortos. A linha superior mostra as culturas do grupo controle ea linha inferior mostra fatias expostas a 28 ° C por 90 min. Mão esquerda, pré-seleciona as imagens não mostram nenhuma lesão CA1. Relativa lesão escala de calibração de cores é mostrado na imagem superior esquerda. Imagens linha do meio mostram lesão cultura relativa fatia de 24 horas após a exposição a 20 mM NMDA. Observe que o falso controle de lesão é maior do que culturas expostas a frio pré-condicionamento (PC). Tradicionalmente, as culturas são expostas a 20 mM NMDA durante a noite para maximizar CA1 níveis de lesão neuronal e lesões relativa de CP v. farsa, anotado como uma relação de lesão / lesão máxima. Entretanto, a exposição a estímulos lesão máxima pode não ser suficiente para superar a neuroproteção de pré-condicionamento. Assim, o uso de índices de lesões / ferimentos máxima pode não refletir com precisão a neuroproteção de pré-condicionamento. Isto é evidente nas imagens que mostram a mão direita CP níveis máximos são inferiores aos dos controles sham. Figura 3. Esquemáticos ilustrando a utilidade de usar inicial, primeiro dia medições para quantificar os níveis de lesão na pré-condicionamento frio experimentos. Como mencionado acima, encontramos que o uso de índices (lesão / lesão máxima) pode obscurecer a neuroproteção de frio pré-condicionamento. Isto pode ser visto a partir do esquema para a esquerda, onde ferimentos farsa é mostrado em vermelho e que, depois de frio pré-condicionamento em azul. Um dia após a exposição ao frio NMDA pré-condicionamento mostra um parente nível "3" de lesão v. sham ("5") de controle, de acordo com neuroproteção 40%. No entanto, se um formato tradicional com ratios (ou seja, lesões / ferimentos máxima) é usado, nenhuma proteção é evidente [ie, (10/05) = 50% para sham v. (06/03) = 50% para cold-pré-condicionamento ]. Figura 4. Resultado qPCR Typial são mostrados. Superior curva do número de cópias de RNA v. ciclo limite para a amplificação mostrando controles (azul) e amostras experimentais (vermelho). Imagem inferior mostra perfis de amplificação típico para quatro amostras (preto, verde, amarelo e roxo). Observe o último ciclos limite Ct (marcado pela linha laranja) ocorrem em 26,0, 29,5, 31,0 e 32,5. Figura 5. Duplo-label imunocoloração usado para confirmar qPCR e resultados disposição qPCR A cultura fatia foi processado para IL-11 (vermelho) e NeuN (verde, para marcar os neurônios). Sondar qual o loci expressão celular de IL-11. Observe que alguns neurônios piramidais (setas) mostram IL-11 e coloração NeuN (amarelo), enquanto algumas células menores (setas), presume-se que os astrócitos, mostram só aumentou IL-11 coloração (vermelho).