אסטרטגיות לחקר neuroprotection מן הקרה נפשית מראש

טכניקות סטרילית aseptic הן קריטיות בהכנה, תחזוקה ושימוש של תרבויות פרוסה במשך תקופות ממושכות. יתר על כן, הרציונל לשימוש שלנו של תרבויות פרוסה רק לאחר 18 ימים במבחנה מבוסס על ראיות לכך מציין מעוררים והעברה סינפטית מעכבות הופך הבשל ביותר, ואת גליה (האסטרוציטים ו microglia) להיות שקט ועקבי עם עמיתיהם שלהם vivo (איור 1 ). 1. הכנה ותחזוקה של תרבויות Slice בהיפוקמפוס באותו יום של culturing, לאזן מוסיף סטרילי ב 1.1 צמיחה התקשורת מ"ל בהיקף של 50 בסל מ"ל בינוני הנשר, 25 פתרון מאוזן מ"ל של ארל מלח, 23 מ"ל סוס סרום, 0.5 מ"ל Glutamax (200 מניות מ"מ), 0.1 מ"ל גנטמיצין (10 מ"ג / מניות מ"ל), 0.4 מ"ל Fungizone (250 מיקרוגרם / מ"ל), 1.45 מ"ל D-גלוקוז (45%; 42 סך mM). שמור שישה מגשים היטב באינקובטור ב 36 מעלות צלזיוס, פחמן דו חמצני 5% ו 95% לחות. עקרות עבור מרבית, culturing נעשית באופן אידיאלי חדר HEPA מסונן תרבות חיובית עם לחץ אוויר מטוהר גם דרך עצמאי אור אולטרה סגול אוויר טיהור אוהדים, ובעוד ללבוש חלוק מעבדה נקי וכפפות סטריליות נמתח על השרוולים חלוק . הכן תרבויות פרוסה במנדף קטר BSL-1 למינרית הכוללת את כל החומרים הדרושים (כלומר, המסוק McIlwain רקמות, הקשורים מוסיף טפלון, סכין גילוח חיתוך, ביתור קר (3-4 מעלות צלזיוס) צלחת, כלים כירורגיים, ו לנתיחה צלחות פטרי) באמצעות stereomicroscope Wild (M8). אפשר צלחת קירור (לברוח אמבט מים סמוכים) כדי להגיע לטמפרטורה 3-4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות בעוד באותו זמן חשיפת חומרים לנתיחה לאור אולטרה סגול כדי להמשיך ולבסס עקרות האזור לנתיחה וכלים. הברדס זרימה למינרית נבדקת מעת לעת כדי להבטיח את האור האולטרה סגול יש מספיק כוח ברמה השולחן עם מד האור האולטרה סגול בגלים קצרים מדידה. השתמש גורי חולדה (-P8 P9 ו ~ 23 גרם / EA. מ המלטות ונבחרים עד 10 בלידה) הרדים עם פחמן דו חמצני 100% בקופסה חיה קטנה על ספסל aseptic מאחורי עשן מכסה המנוע נקי על ידי טבילה באתנול 100% בתוך את מכסה המנוע קטר, שבו כל השלבים הבאים מבוצעים. לערוף את הגורים במחצית אחת צלחת פטרי 100 מ"מ מקום ראש במחצית השנייה, באמצעות צלחת מתוקים לכל גור. לנתח את המוח ואת המקום אותו בחצי התחתון של צלחת פטרי 60 מ"מ המכיל 10 מ"ל סטרילי קר (3-4 מעלות צלזיוס) גיי של פתרון מאוזן מלח בתוספת גלוקוז-D עד 6.5 מ"ג / מ"ל ​​(כלומר 7.5 מ"ל של 45 % d-גלוקוז לבקבוק 500 מ"ל של גיי. לנתח את ההיפוקמפוס מן האונה כל ומניחים אותם על גבי דיסק טפלון עבור המסוק McIlwain. מורחים התקשורת הרחק רקמת המוח בעזרת מרית איריס למנוע חלקים במוח לחתוך מן הדבקות להב החיתוך. סעיף hippocampi בניצב לציר הארוך שלהם באמצעות מסוק McIlwain, עם עובי סעיף נקבע 350-400 מיקרומטר. בזריזות לשטוף טרי לחתוך את פרוסות של מוסיף טפלון לתוך החלק העליון של צלחת פטרי המכילה 60 מ"מ קר (3-4 מעלות צלזיוס) תמיסת מלח מאוזן של גיי עם 6.5 גלוקוז-D מ"ג / מ"ל ​​באמצעות pipettor one מ"ל. בדוק פרוסות תחת stereomicroscope עבור gyrus משוננת שלם שכבת תאים פירמידליים. בעדינות במקום פרוסות הגדולה על הכנס (שלושה לכל להוסיף 12 פרוסות / גור) ולשמור בתנאים נורמליים הדגירה באינקובטור לנקות כל שישה חודשים מכויל כל שלושה חודשים עם נתח דו תחמוצת הפחמן מדחום אינפרא אדום מדויק אל מקום אחד אחרי הנקודה העשרונית. רענן התקשורת הצמיחה מנות כל תרבות 3-4 ימים במבחנה באמצעות מכסה המנוע BSL-2 ו טכניקה סטרילית. לאחר 7 ימים במבחנה, להחליף את התקשורת עם 1.1 סרום ללא מדיה מ"ל (SFM) בהיקף של 97 מ"ל Neurobasal, 2 מ"ל B27, 0.5 מ"ל Glutamax (200 מ"מ), 0.1 מ"ל חומצה אסקורבית (0.5 מ '), ו – 0.68 מ"ל D- גלוקוז (45%, 42 בסך הכל mM). 2. טרום מסך Vitality תרבויות Slice Aliquot Sytox הירוק המניות (10 μL) ולאחסן ב -20 ° C. מדולל מניות Sytox עד 500 nM עובד ריכוז בסרום ללא מדיה צמיחה (כלומר, 10 μL ב 100 התקשורת מ"ל). חנות Sytox מדיה ב 4 ° C ולהשתמש עד שבוע. המקום של 1.1 מ"ל לכל Sytox היטב היטב 6 מנות התרבות חמים 36 ° C ב 5% פחמן דו חמצני לתקופה מספיק (כלומר, כפי שמעידים על חוסר עיבוי הכלים תרבות). בינתיים, לאפשר מנורת אולטרה סגול (כלומר, מקור אור פלורסנט עם מסנן FITC) מופעל באמצעות ספק כוח מיוצב על מנת להבטיח עוצמת האור אחיד לחמם לטמפרטורה של לפחות 20 דקות. מניחים פרוסה תרבויות (18 יוםs במבחנה) ב Sytox מדיה עבור 10 דקות ואז חזרה SFM למסך לפגיעה בלתי הפיכה CA1 שכבת פירמידה. צפה על פני תרבויות aseptic של מיקרוסקופ הפוכה, בדקו בהגדלה 5x. קבל תרבויות עם פחות מ 30 תאים חיובי Sytox באזור CA1. 3. הקרה נפשית מראש המקום של 1.1 מ"ל SFM ב 6-היטב מנות התרבות. אפשר התקשורת מקורר (למשל, 30 ° C) לאזן ב (פחמן דו חמצני 5% ו 95% לחות) באינקובטור במשך לפחות 20 דקות לפני השימוש. העדר העיבוי על הכלים תרבות עולה כי זמן מספיק לצורך איזון התרחשה. העברת התרבות מוסיף פרוסת התקשורת מקורר (1.1 mL / טוב) מגש שמרה על 30 ° C ו דגירה של 90 דקות באמצעות טכניקה סטרילית במנדף BSL-2 קטר. מניחים פרוסה תרבויות בחזרה SFM נורמלי בתנאים נורמליים הדגירה במשך 24 שעות, שוב באמצעות טכניקה סטרילית דרך מכסה המנוע BSL-2 קטר. 4. Excitotoxic פגיעה בגין פרוסה prescreen ניסיוני תרבות השימוש על ידי חשיפת התקשורת Sytox במשך 20 דקות. לרכוש תמונות בודדות פרוסה עם פרוסות לשמור על אוריינטציה דומה לזה המשמש עבור prescreen (תמונות רקע). הדבר נעשה על ידי הצבת סימן שמאלה שני סימני ימינה עם בטוש ב "10" ו "שני" בערב על כל הכנס. תמרון זה מאפשר שימוש באותו אזור של אינטרס צורה לתרבות כל קבוצה של תמונות. במקביל, להפעיל את המקור מנורה אולטרה סגול (תחת אספקת החשמל מוסדר), ואת המצלמה CCD עבור מינימום של 20 דקות כדי להתחמם לטמפרטורה. ואז, לכייל את המצלמה CCD עם תקן fluoroscein. "נקה" CCD ידי חשיפת לאור למשך 50 מחזורים, אלא אם כן המצלמה באופן אוטומטי כיול CCD משמש. הקמנו תוכנית בתוך MetaMorph כדי לנקות מצלמה הצמד מגניב שלנו המשמש כימות פציעה. מקום 10 μL של fluoroscein ב 90 מ"ל PBS (10 mM פוספט חיץ, 150 mM NaCl ב-pH 7.3) ו מערבולת. פיפטה 10 μL של תערובת fluoroscein על hemacytometer 100 מיקרומטר עמוק. התאם את עוצמת תמונה מלאה 1000/4096. איסוף תמונות רקע של תרבויות פרוסה כדי לוודא כי קר נפשית מראש לא לגרום לפציעה (כלומר, למחוק תרבויות עם שטח ≥ 250 CA1 של עוצמת ריבית). הכן מגשים עם התקשורת NMDA. הכן 10 המניות mM פתרון של NMDA לפחות לשבוע. עבור פגיעה excitotoxic, לדלל NMDA עד 20 50 מיקרומטר SFM ו לאזן לתנאי הדגירה נורמלי לפחות 20 דקות. באמצעות מכסה המנוע BSL-2 ו טכניקה סטרילית, מוסיף מקום לתוך NMDA מדיה עבור 60 דקות, בתנאים נורמליים הדגירה. יש לשטוף את NMDA של מוסיף על ידי טבילה כל להכניס שלוש פעמים בשלוש מנות נפרדות 60 מ"מ כל Neurobasal המכיל 10 מ"ל חימם עד 36 ° C. אין להשתמש יותר משלושה מוסיף עבור כל קבוצה של שלושה 60 מנות לשטוף מ"מ. חזור תרבויות לתנאי הדגירה נורמלי. איסוף התמונות פגיעה 24 שעות לאחר החשיפה NMDA. כיול מצלמה עם fluoroscein תקן כפי שתואר לעיל. המקום תרבויות בתקשורת Sytox עבור 20 דקות. לכמת פגיעה: שימוש בתוכנת MetaMorph, לצייר AOI סביב אזור CA1. מדידת העוצמה של האזור שנבחר עבור "פציעה". העתק והדבק AOI של "פגיעה" לתמונה "רקע". הזן ערכים "פציעה" או "רקע" לתוך Excel. לכמת "המונה-רקע" לבקרה הקרה preconditioned תרבויות. באמצעות תוכנה סטטיסטית (למשל, SigmaStat), להריץ בדיקות סטטיסטיות מתאימות להשוות פציעה של קבוצת הניסוי (ים) לעומת קבוצת ביקורת, אשר תמיד צריך להיות כלול לרוץ כל הניסוי. הערה: אם רמות פציעה נמוכים של יום אחד לאחר פציעה תמונות, לשאת את הניסוי לשני שלושה ימים. הגנה בתרבויות עשוי להיות רעולי פנים בשל חוסר הרגישות של פציעה (איור 2). הערה: הנושא של "הגנה" תתבקש לנו לעבור רמות פציעה מדידה לא יחסי לכל ההשוואות (איור 3). 5. עמית טיפולים יישומית עם הקרה נפשית מראש יתרון חשוב של תרבויות פרוסה היא כי תנאי הסביבהזה יכול להיות נשלט במדויק. משמעות הדבר היא כי ציטוקינים איתות מהקור-נפשית מראש ניתן למדוד, חיקה, ומתנגן לנתח את ההיבטים צומת קריטי. רקומביננטי (למשל, אגוניסט) חלבונים ונטרול (למשל, נוגדן או קולטן מסיס) חלבונים יכולים לשמש לחקות ולווסת, בהתאמה, איתות ציטוקינים. באופן כללי, חלבונים אלו הם מחדש ומאוחסנים כמו aliquots ב -20 ° C לשימוש בתוך שישה חודשים כדי להבטיח bioactivity הולם. כאן אנו מתארים שימוש מופתי של ביטול איתות TNF-α באמצעות קולטן מסיס TNF 1 (sTNFR1). מחדש sTNFR1 בסרום שור 0.1% אלבומין PBS למלאי של 50 מיקרוגרם / מ"ל, aliquot ב 20-50 כמויות μL, ולאחסן ב -20 ° C. לשימוש, לדלל sTNFR1 עד 200 ng / mL בתרבויות התקשורת פרוסה צמיחה מחומם ל 36 ° C ו פרוסה מקום תרבויות sTNFR1 מדיה עבור 20 דקות לפני קר נפשית מראש. הערה: כדי לצמצם את השונות, עדיף לדלל 200 ng / mL sTNFR1 בנפח גדול של התקשורת הצמיחה (כלומר, דילול 1:250 מתוך 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​sTNFR1 המניה ב 10 מ"ל של התקשורת צמיחה דורש 40 μL sTNFR1) לעומת הוספת sTNFR1 ישירות היטב כל מאכל (4.4 μL לכל 1.1 התקשורת מ"ל). מדולל sTNFR1 עד 200 ng / mL בתקשורת ומקום 1.1 מ"ל להכניס כל טוב. אפשר התקשורת לאזן עד 30 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני חשיפת תרבויות פרוסה על קר נפשית מראש עבור 90 דקות כפי שתואר לעיל. מניחים פרוסה תרבויות בחזרה 36 ° C עם ההווה sTNFR1 בתקשורת. 24 שעות מאוחר יותר, כדי לחשוף תרבויות Sytox מדיה 20 דקות כפי שתואר לעיל, לאסוף תמונות רקע כדי לוודא כי קר נפשית מראש לא לפגוע תרבויות. לכמת את הנתונים כפי שתואר לעיל. רענן התקשורת עם רכיבים כל 3-4 ימים במבחנה. 6. פגיעה Excitotoxic מיידי ועיכב לאחר הקרה נפשית מראש פציעה מיידי עם קר נפשית מראש. בצע קר נפשית מראש כמתואר לעיל. לאחר קר נפשית מראש, לחזור אל תרבויות הדגירה נורמלי 20 דקות. לאחר מכן, חושפים תרבויות לפגיעה 20-50 מיקרומטר NMDA במשך שעה אחת. לשטוף תרבויות שלוש פעמים כמתואר לעיל ולחזור הדגירה נורמלי. לאחר 24 שעות, לרכוש תמונות פגיעה כמתואר לעיל. עיכוב השפעות קר נפשית מראש. בצע קר נפשית מראש כמתואר לעיל. לחשוף תרבויות לפגיעה NMDA כעבור 24 שעות כפי שתואר לעיל. המשך לרכוש תמונות פציעה עד שלושה ימים לאחר הראשוני קר נפשית מראש כדי לפקח על הגנה. 7. בידוד RNA הביטוי הנהלים הבאים הגן הם מדורגים לתרבות פרוסה אחת. העברת תרבויות פרוסה מהתקשורת צמיחה הדגירה נורמלי RNAlater 3 מ"ל 6-היטב מנות תרבות לייצב RNA. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שלושה ימים עד מעובד כמתואר להלן. הרם בעדינות את התרבות לחתוך להכניס את עם מברשת צבע עדין קצה ומניחים מ"ל 1 של קר (4 ° C) PBS ב 1.5 מ"ל (DNase, RNase, ו-DNA חינם) צינור microcentrifuge. צנטריפוגה הדגימות למשך 30 שניות ולהסיר PBS supernatant. חנות דגימות ב -80 ° C. כדי לבודד RNA מתרבויות פרוסה (~ 250 ng / EA.) דגימות להפשיר את הקרח. לבודד RNA באמצעות ערכת Qiagen MicroRNeasy באמצעות ההליכים הבאים המתוארים ופרטים נוספים המותאמים מן מיקרו RNeasy Handbook (Qiagen). 350 מקום RLT μL הצפת (המכיל 10 μL β-mercaptoethanol לכל מ"ל) לתוך צינור microcentrifuge כל אחד המכיל תרבות פרוסה. Homogenize דגימות ידי vortexing למשך 30 שניות. Triturate רקמות, במידת הצורך (כלומר, רקמת גלולה גלוי עדיין) באמצעות העלי הפנויה עד הומוגני לחלוטין RLT חוצץ. מקום 350 μL של אתנול 70% לתערובת lysate ו פיפטה לערבב. העברת homogenate לעמודה ספין מקום בצינור אוסף (גם טור ספין צינור איסוף מסופקים על ידי Qiagen). צנטריפוגה מדגם של 15 שניות על מהירות מרבית. שמור את הטור. לשטוף את העמודה ספין על ידי הוספת 350 RW1 הצפת צנטריפוגות μL פלוס במשך 15 שניות במהירות מקסימלית. בטל חיץ. מדולל 10 μL של המניה אני DNase ב הצפת 70 μL RDD להניב 80 הנפח הכולל μL. פיפטה בעדינות לתערובת לא מערבולת. הכן 80 μL של המניה DNase המדולל המדגם. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוספת 350 RW1 הצפת μL מדגם טור ספין צנטריפוגות במשך 15 שניות. בטל צינור איסוף. באמצעות צינור אוסף חדש, להוסיף 500 הרשתית הצפת μL המדגם ו צנטריפוגות במשך 15 שניות וזורקים חיץ. מקום 500 μL של אתנול 80% על מדגם צנטריפוגות דקות 2. מחק את צינור האיסוף. יבש את העמודות ספין על ידי centrifuging 5 דקות במהירות מקסימלית עם כמוסות צינור פתוח, להשליך צינורות איסוף, ספין העברת עמודה צינור 1.5 מ"ל אוסף מסופק על ידי הערכה. כדי לאסוף RNA בודד, 14 μL מקום RNase ללא מים במרכז הממברנה טור ספין. צנטריפוגה דקות אחד לאסוף את הנוזל. הוסף 2 μL של RNasin (בדילול מלא ב U 1 / μL ב TE חיץ) ולאחסן ב -80 ° C. TE המאגר מכיל 10 mM טריס (טריס aminomethane [hydroxymethyl]), 1mm EDTA (ethylenediaminetetraacetic חומצה מימה disodium מלח) ב-pH 8.0. 8. RNA כימות הערה: RNasin לא להפריע assay RiboGreen. מדולל RiboGreen 1:200 במאגר TE RNase ללא כדלקמן. TE (מ"ל): 1; Ribogreen (μL): 5; TE (מ"ל): 4; Ribogreen (μL): 20; TE (מ"ל): 6; Ribogreen (μL): 30. סטנדרטים RNA מוכנים כדלקמן. שמרים tRNA משמש תקן RNA. tRNA מאוחסן (-20 ° C) כמו 1 מ"ג / מ"ל ​​ב TE חיץ. לדלל את 1 מ"ג / מ"ל ​​מניות 1:100 ב TE חיץ, תוך שימוש (DNase, RNase, ו-DNA חינם) 1.5 microcentrifuge צינורות מ"ל לייצר 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​רגיל לעבוד. הכן את עקומת סטנדרט ישירות צלחת 96 היטב assay ניאון על ידי הוספת diluent חיץ TE הראשון, ולאחר מכן להוסיף את הכמות המתאימה של תקן מיקרוגרם / מ"ל ​​1 לתוך המאגר TE כבר בארות צלחת כמוצג בטבלה הסמוכה. בצע לשכפל בארות תקן כל כדלקמן. Vol. של std. (ΜL): 100, Vol. של TE (μL): 0; RNA היטב (נ"ג) 100; Vol. של std. (ΜL): 80, Vol. של TE (μL): 20; RNA היטב (נ"ג): 80; Vol. של std. (ΜL): 60, Vol. של TE (μL): 40; RNA היטב (נ"ג): 60; Vol. של std. (ΜL): 40, Vol. של TE (μL): 60; RNA היטב (נ"ג): 40; Vol. של std. (ΜL): 20, Vol. של TE (μL): 80; RNA היטב (נ"ג): 20; Vol. של std. (ΜL): 0; Vol. של TE (μL): 0; RNA היטב (נ"ג): 0. Assay מוכן כדלקמן. הוסף 99 μL של TE חוצץ לכל אחד בארות מדגם של צלחת 96 הבאר. הדרך היעילה ביותר לעשות זאת היא להשתמש pipettor רב. הוסף 1 μL של רנ"א על ​​בארות מדגם ניסיוני. הוספת 100 μL של RiboGreen בדילול זה גם באמצעות pipettor רב ו triturate עם אחד או שניים משיכות של pipettor. קרא את הצלחת על הקורא צלחת ניאון על עירור 480 ננומטר 520 פליטה ננומטר. בניית עקומת סטנדרט באמצעות Microsoft Excel עם עוצמות הקרינה נמדדת בסטנדרטים של רנ"א. חישוב ריכוזים RNA בדגימות באמצעות משוואה ליניארית הנובע עקומת הסטנדרטים. 9. SYBR גרין PCR כמותי נהלים PCR נעשים הטובה ביותר באזור נקי שמורות במיוחד לעבוד עם רנ"א (איור 4). לטהר את האזור ציוד מעבדה הקשורות מזיהום DNA פוטנציאל פעילות RNase לפני השימוש עם האור האולטרה סגול, אקונומיקה 10% או RNase Away. לבשו כפפות לאורך כל ההליכים. השתמשו במים RNase חינם לכל הנהלים כאמור עם ערכת. אין להשתמש DEPC-(diethylpyrocarbonate) מים מטופלים. סגור את כל PCR הקשורות צינורות מיד לאחר השימוש לזיהום אירוסול מפגר של דנ"א זר. פיתוח ולאפיין primers עבור יעד את ה-mRNA (ים) של עניין. שיטות אלה מפורטים שיטות משלים כדי האלסה et al. Journal of Neuroscience, 2008 13. cDNA מיוצר 3-20 RNA סך ng באמצעות שעתוק לאחור באמצעות iScript. הבחירה להתחיל כמות הרנ"א נקבעת על ידי הכמות הכוללת של RNA זמין במטרה לבצע ניתוח RT-PCR על חלק של המדגם (כלומר, 10% -20% מכלל). החלק הנותר גדול יותר של רנ"א מאוחסן לצורך ניתוח עתידי. ערכת iScript מנצל תערובת של hexamers אקראי אוליגו DT-primers, וכן transcriptase שונה MMLV הפוך בהיקף כולל של 20 μL. שעתוק הפוך התמורה עבור 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ואחריו 42 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות, ואת transcriptase הפוכה הוא מפוגל לאחר מכן ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מדולל cDNA במאגר TE לריכוז סופי של יחסי 0.4 ng / μL כדי להתחיל כמות רנ"א. SYBR גרין אסטרטגיה PCR מבוסס משמש להגביר cDNA. PCR תגובות מנוטרים בזמן אמת על ידי ניטור ההתאגדות SYBR הירוק. 50 תגובות μL להכיל 3 מ"מ MgCl 2, 200 מיקרומטר dNTPs, 15 pmol כל primers קדימה הפוכה, 1 מיקרומטר והעמסת, 1x SYBR צבען הירוק, 10 μL (4 ng) תרבות פרוסה cDNA, ו 1.25 U פלטינום תקי פולימראז בתגובה חיץ המורכב של 50 מ"מ ו KCl 10 mM טריס, pH 8.3. PCR מתבצעת באמצעות thermocycler iCycler שיכול לאסוף נתונים בזמן אמת. פרמטרים אופניים מורכבים denaturation 15 שניות (95 ° C) ואחריו סיומת 30 שניות / חישול (60 ° C) חוזרות ונשנות 45 פעמים. מדידות אופטיות נלקחים במהלך השלב / הרחבה חישול וערכים Ct נקבעו באמצעות תוכנת המערכת iCycler. cDNA עבור מטרות ציטוקינים עניין β-אקטין משמשים לבניית עקומות סטנדרטיות. מספר העתק נקבעת משקל המסה המולקולרית של cDNA פלסמיד. עקומות האחיד של מספר העתק / מסה בנויים וכלל assay כל אחד. ערכים Ct עבור דילול כל cDNA משמשים כדי לקבוע את מספר עותק עקומת נ CT. ציטוקין ו β-אקטין מספר רמות להעתיק נקבעים על דגימות באמצעות עקומות סטנדרטיות. 10. כמותי PCR עבור microarrays מערך כמותי בזמן אמת ההקרנה qPCR היא אמצעי רגיש מאוד לשחזור לחקור עבור ברמה נמוכה השינויים ביטוי דלקתי מתווך. Profiler RT2 מערך ה-PCR מ SABiosciences משמש הגן שינויים דלקתיים המתווך הביטוי, עם השלבים הבאים מתוארים בפירוט נוסף על ידי היצרן. Assay משתמשת 0.1-1.0 מיקרוגרם RNA. אנו משתמשים באזורים פרוסה המקומית (למשל, CA1 המספק ~ 250 RNA סך ng משתי דוגמאות אספו) או פרוסות אחד שלם כי מכילים כמות דומה של רנ"א מוחלט. RNAs לדוגמה ושליטה מתועתקים הפוכה cDNA באמצעות ערכת גדיל הראשונה (לדוגמה, # C-03). CDNA כתוצאה מעורבב עם SYBR גרין מבוססי PCR לערבב (# PA-011) ו – 25 μL aliquotted לתוך כל אחד 96 בארות הצלחת מערך ה-PCR (מדידה 84 גנים ניסיוני ייחודי 16 גנים משק בית). אחת צלחת מערך מוכן מדגם הניסוי וצלחת השני הוא מוכן לשלוט. הערה: לערבב גרין SYBR מאסטר המסופק על ידי היצרן היא תרמית Cycler ספציפיים. רכיבה תרמית נעשית באמצעות iCycler עם פרוטוקול 40 מחזור המורכב צעד denaturation של 15 שניות על 95 ° C ואחריו צעד שלוחה של דקות אחד בכל 60 ° C. נתונים אופטית נאסף במהלך שלב ההארכה. רכיבה תרמית ואחריו ניתוח עקומת להמיס סריקת 55-95 מעלות צלזיוס טווח טמפרטורות ב 0.5 ° C במרווחים. הביטוי היחסי של הגנים צלחות טיפול ושליטה נקבע באמצעות 2 – שיטה ΔΔCt באמצעות התוכנה המסופקת Excel מבוסס כפי שבאה לידי ביטוי בגידול לקפל או להקטין באופן יחסי שולט. גנים עם כפולה להגדיל או להקטין את הביטוי נחשבים לצורך הערכה נוספת. הגנים שזוהו מן ההקרנה מערך ה-PCR (למשל, באמצעות # פרן-011A עבור נפשית מראש קר) הם confirme נוסףד באמצעות qPCR. מערכי ה-PCR לזהות אילו גנים מוסדרים בתגובה לגירויים. בדוגמה של קר נפשית מראש, זיהינו את הגן IL-11 כמו מוסדר באופן חיובי בתגובה קר נפשית מראש. השלב הבא הוא ניתוח כדי לאשר את הגן זיהו לאחרונה מוסדר בתרבויות פרוסה באמצעות assay qPCR כמפורט לעיל. 11. Multiplexed תזרים microsphere Assay proteomic Cytometric לחשוף תרבויות פרוסה על קר נפשית מראש כמתואר לעיל. פרוסה קציר תרבויות עבור assay החלבון הכולל. הרם בעדינות את פרוסות להכניס את קצה בעזרת מברשת עדינה ומניחים 1 מ"ל קר (4 ° C) PBS. צנטריפוגה צינורות להסיר את PBS תרבויות פרוסה. מניחים על קרח יבש עד קצירת נגמר. חנות צינורות ב -80 ° C. Homogenize תרבות דגימות פרוסה לביצוע assay החלבון הכולל. הכן תמוגה חוצץ התא homogenization. בעקבות הוראות היצרן (Bio-Rad), מעכבי הפרוטאז כדי להוסיף 5 מ"ל של חיץ תמוגה ומניחים בצד על הקרח. 100 מקום μL של חיץ תמוגה על תרבויות פרוסה ופרוסות להתסיס ידי pipetting למעלה ולמטה חמש פעמים עם טיפ 100 פיפטה μL לחתוך פתוח מ"מ 1. Shake דגימות בצלחת שייקר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. צנטריפוגה דגימות 13,000 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 ° C. העברת supernatant לצינור נקי ומניחים בצד על הקרח. בצע assay החלבון הכולל. הכן BSA (שור אלבומין) סטנדרטים חלבון. המניות מחדש BSA עם מים ultrapure בהתאם להוראות היצרן. הכנת תקנים חלבון הנעים 0000-1000 מיקרוגרם / מ"ל, בדילול מלא חיץ תמוגה. חשב את נפח העבודה מגיב הדרוש בהתאם להוראות הערכה. לדוגמה, (שמונה תקנים + 18 דגימות לא ידוע) x (שני משכפל) x (200 מגיב עבודה μL הנדרש לדגימה) = 10.4 mL של הנפח הכולל של מגיב עובד נדרש לטעון על 96 microplate היטב (למשל, זרימת assay microsphere cytometric , ראה להלן). כאשר מגיב ערבוב עם B מגיב, עכירות מסוימים עשויים להתרחש, אבל צריך להיעלם בקרוב. טען 10 μL של סטנדרטים דגימות על microplate. טען 0.2 מ"ל של ריאגנט עובד לתוך בארות. כיסוי microplate עם הקלטת איטום ללחוץ על צלחת שייקר למשך 30 שניות. דגירה microplate על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. Microplate מצננים לטמפרטורת החדר (כ 10 דקות) לפני קריאת על הקורא צלחת באורך גל 595 ננומטר. בניית עקומת סטנדרט באמצעות Microsoft Excel עם absorbances נמדדת בסטנדרטים BSA. חישוב ריכוז חלבון בדגימות באמצעות משוואה ליניארית הנובע עקומת הסטנדרטים. לדלל כל דגימות לריכוז הנמוך ביותר שנמדד עם חיץ תמוגה ולאחסן ב -80 ° C. בצע אחת Plex ו ציטוקינים רקמות זמנית (או נוזל) מבחני כפי שתואר בפירוט מלא הפניות # 12 ו – 16. 12. אימונוהיסטוכימיה תקן תרבויות במשך 24 שעות עם מקבע PLP המורכב paraformaldehyde מ"ל 10 16%, 1.096 גרם ליזין, פוספט 0.42 גרם נתרן 0.17 גרם נתרן periodate, מלא עד נפח כולל של 80 מ"ל עם מים ultrapure (מקבע הוא 6.2 pH). אנו מוצאים כי PLP מקבע הוא מקבע עדין המאפשר זיהוי של immunostaining ברמה נמוכה כי אחרת לא יהיה ניכר באמצעות fixatives אחרים. תרבויות הם קבועים למשך 24 שעות, מועברים בעזרת מברשת בסדר אזיד הנתרן PBS המכיל (100 מ"ג / ליטר). Immunostaining שדה מוארת של תרבויות צפות פרוסה שלמה מושגת כדלקמן עם כל הצעדים מצמידים רועד בסל"ד 50 ~. לשטוף תרבויות פרוסה 3 מ"ל PBS שלוש פעמים 10 דקות. להרוות תרבויות פרוסה ב -0.3% H 2 O 2. מדולל 30% H 2 O 2 פתרון המניות PBS. לשטוף תרבויות פרוסה PBS שלוש פעמים, 10 דקות כל אחד. בלוק תרבויות פרוסה שעה אחת בטמפרטורת החדר בפתרון 3 מ"ל חסימת בצלחת שש היטב המורכבת סרום 10 מ"ל עז, 0.75 מ"ל טריטון X-100, ו – 89.25 מ"ל PBS. סרום לפתרון חסימת צריכה לבוא מאותו המין שבה נוגדנים משני הועלתה. דגירה תרבויות פרוסה לילה נוגדן ראשוני מדולל פתרון לחסימת ב 4 ° C. נפח מרבי של פתרון הנוגדן העיקרי קטן צלחת זכוכית פיירקס בארות צריך להיות 0.3 כרכים מ"ל גבוה נוטים לדרוס את שולי הצלחת. מניחים את המנה בכלי סגור humidified. אנחנו לא לכסות את המנה עם הסרט חסיד מאז חלקים עשוי להיות סובב על הסרט שמעל ואיבד את הבדיקות עוד יותר. התאם רועד מהירות צלחת שייקר גבוה מספיק כדי להפיץ פרוסות בפתרון נוגדן. הסר פרוסות מהצלחת זכוכית PBS להתרחץ שלוש פעמים 10 דקות לכל לשטוף. דגירה הפרוסות משני הנוגדנים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת תוך רעד. השתמש קטן זכוכית פיירקס מנות לטעון 0.3 פתרון משני מ"ל נוגדן. לשטוף שלוש פעמים PBS, 10 דקות לכל לשטוף. דמיינו מכתים עם 3'-diaminobenzidine (DAB). להמיס 30 מ"ג DAB ב sulfoxide 3 דימתיל מ"ל. סנן DAB באמצעות שני # 1 ניירות לסנן ולשטוף עם 54 מ"ל PBS. מיד לפני השימוש, מוסיפים 20 μL של 30% H 2 O 2. דגירה תרבויות פתרון DAB עבור 5-7 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: DAB הוא קרצינוגן ויש להיפטר כראוי. השלך את כל הפתרונות DAB במיכל מסומן מאוחסנים ברדס קטר, והמקום כל הכלים בתמיסה אקונומיקה כדי לבטל DAB. כל הפתרונות DAB בסופו של דבר צריך להיות מושלך באמצעות משרד בטיחות מוסדיים. לשטוף תרבויות פרוסה PBS שלוש פעמים 10 דקות כל אחד. רטוב הר תרבויות פרוסה על ג'לטין (או silane) שקופיות מצופה סבון 100 צלחת μL מומס במים מזוקקים. יבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר. הימנע משימוש מחממי שקופיות חום מופרז עלול לגרום פיצוח בתרבויות רכוב על שקופיות. מייבשים שקופיות באמצעות סדרה של אתנול מדורגים (50, 75, 95, 95, 100, 100%) למשך 30 שניות כל אחד. נקה שקופיות עם ארבע פעמים קסילן דקות עשר כל אחד. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, במקום 0.1 מ"ל של התקשורת גובר על גבי שקופיות coverslip בעדינות כדי למנוע בועות אוויר ויוצרים. יבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר. פלורסנט immunostaining. פרוסה סעיף תרבויות עד 20 מיקרומטר עבה באמצעות cryostat. התאם את הגדרות cryostat ל -16 מעלות חום פנימי -12 מעלות חום האובייקט. מניחים כמות קטנה של מים על מתכת צ'אק בעזרת פיפטה פסטר הקפאת קרח יבש. למרוח שכבה דקה של רקמה דיסק-Tek התקשורת על גבי צ'אק קפוא. אפשר לזרוק להקפיא לאזן לטמפרטורת החדר cryostat. רקמות-Tek סעיף התקשורת כדי ליצור משטח שטוח מתאים להנחת תרבויות פרוסה שטוח. הערה הכיוון של צ'אק בעוד חתך זה מספק זווית עקבית חתך שימנעו התקשורת הרכבה מליפול צ'אק. כאשר קפוא, לקחת לזרוק החוצה מקום בעל. בעזרת מרית מתכת עדין קצה מברשת צבע, שקופיות תרבות אחת על פרוסת מרית ולהעביר לידיבאמצע השכבה שטוח של רקמה-Tek התקשורת על צ'אק. מניחים שכבה דקה של רקמה-Tek התקשורת על התרבות פרוסה רכוב ולהקפיא בטמפרטורת החדר במשך לפחות 10 דקות. עם כפתור "לקצץ" הופעל, בסעיף השכבות העליונות של רקמות-Tek התקשורת עד התרבות פרוסה גלוי. החלף מ "קיצוץ" כדי מראש "בסעיף" ב 20 מיקרומטר. איסוף סעיפים 20 מיקרומטר עם ג'לטין מצופה שקופיות כי הם בטמפרטורת החדר שקופיות יבש למשך הלילה. רקמות-Tek התקשורת יהיה גלוי בשקופיות, אבל מתמוסס שוטף PBS. Immunostaining. לשטוף שקופיות PBS שלוש פעמים 10 דקות כל אחד. להרוות ב -0.3% H 2 O 2 במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, רועד. לשטוף שקופיות PBS שלוש פעמים 10 דקות כל אחד. שימוש SFX אות משפר, חלים כמה טיפות של רכיב ישירות על גבי החלקים בשקופית ולאחר דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא humidified. דגירה עם מרכיב מחליף את הצעד חסימת פתרון עיזים 10% נסיוב שבוצעו אימונוהיסטוכימיה שדה בהיר. מגלשות דגירה של נוגדנים העיקרי בדילול מלא 0.75% Triton X-100 ב PBS במשך שעתיים על 37 ° C. החל פתרון נוגדן ראשוני ישירות גבי שקופיות לדגור בחדר humidified כדי למנוע אידוי. אין לכלול סרום בכל הפתרונות נוגדן להשתמש רק PBS ואת טריטון X-100. לשטוף שקופיות PBS שלוש פעמים 10 דקות כל אחד. דגירה של נוגדנים משני שעה אחת בטמפרטורת החדר ולהגן מפני אור שקופיות. כל צנטריפוגה נוגדנים משני ניאון עבור 20 דקות כדי למנוע כל אגרגטים להגיע אל הפתרון נוגדן. הכן דילולים באמצעות נוגדן 0.75% Triton X-100 ב PBS. לשטוף שקופיות PBS שלוש פעמים 10 דקות כל אחד. טובלים שקופיות פעם במים מזוקקים כדי לשטוף את המלחים מן PBS. מגלשות יבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר, מכוסה מן האור. Coverslip שקופיות עם התקשורת להאריך Antifade. רכיב הפשרה במיקרוגל במשך 50-10 שניות ומוסיפים כ 1 מ"ל ל בקבוקון של רכיב ב מערבבים בעזרת פיפטה Pastuer, נזהר לא להכניס בועות אוויר לתוך התמיסה. צנטריפוגה במשך 5 דקות במהירות מקסימלית כדי להסיר בועות. למרוח שכבה דקה של התקשורת להאריך גבי שקופיות בעזרת פיפטה Pastuer, זהיר ולהימנע מיצירת בועות אוויר. במקום לכסות בעדינות להחליק על גבי שקופיות יבש במשך הלילה, מכוסה מן האור. פעמיים תווית Immunostaining ניאון (איור 5). בצע פלורסנט Immunostaining כמתואר לעיל, אלא לדלל הן נוגדנים העיקרי בפתרון הדגירה אותו. לדלל כל נוגדנים משני הפתרון אותו דגירה כמתואר לעיל. תקופות הדגירה סידורי באמצעות שני נוגדנים הביא immunostaining פחתה. 13. נציג תוצאות באיור 1. מראה של תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס microglia. הדימוי יד שמאל מופעי תרבות טיפוסי בוגרת (כלומר, 21 יום במבחנה) פרוסה בהיפוקמפוס כתם עם NeuN (ירוק) כדי להמחיש את cytoarchitecture של הנוירונים העיקריים. עצב פירמידליים מוצגים באזורים CA1 ו CA3 ו שקעאכלו gyrus (DG) נוירונים שמאלה. בר סולם הוא 250 מיקרומטר. התמונה הימנית היא נגזרת באזור CA1 ומוצגות בהספק גבוה כדי להמחיש את איכות מסועפת של microglia שקט בתוך תרבויות פרוסה בוגרת. תאים סומנו סמן את פני השטח microglial, cd11b. בר סולם הוא 50 מיקרומטר. איור 2. הקרה נפשית מראש neuroprotection בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס. תרבויות מודגרת עם Sytox גרין, סמן פלואורסצנטי מסומנים תאים מתים. השורה העליונה מראה תרבויות דמה מלאה השורה התחתונה מראה פרוסות חשוף 28 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. השמאל, לעומת טרום מסך התמונות לא מראות פגיעה CA1. פגיעה יחסית בקנה מידה כיול צבע מוצג בתמונה השמאלית העליונה. תמונות בשורה התיכון להראות פגיעה יחסית התרבות פרוסה 24 שעות לאחר החשיפה 20 מיקרומטר NMDA. שימו לב כי פגיעה דמה שליטה גדולה מזו של תרבויות חשופים נפשית מראש קר (CP). באופן מסורתי, נחשפים לתרבויות אז 20 מיקרומטר NMDA לילה על מנת למקסם את CA1 רמות פגיעה עצבית ופגיעה היחסי של CP נ דמה, כאמור יחס של פגיעה / פציעה מירבית. עם זאת, חשיפה לגירויים פגיעה מירבית עלול שלא להספיק כדי להתגבר על neuroprotection מ נפשית מראש. לפיכך, השימוש יחסי של פגיעה / פציעה מירבית לא יכול לשקף במדויק neuroprotection מ נפשית מראש. הדבר בא לידי ביטוי בתמונות יד ימין המראים רמות מקסימלי CP הם פחות מאלה של הבקרות דמה. איור 3. סכמטי המדגים את התועלת של השימוש הראשוני, מדידות ביום הראשון כדי לכמת רמות הפציעה בקור-נפשית מראש ניסויים. כפי שצוין לעיל, מצאנו כי השימוש יחסי (פציעה / פגיעה מירבית) יכול לטשטש neuroprotection מפני הקור מיזוג מראש. ניתן לראות זאת מן סכמטית משמאל היכן פציעה זיוף מוצג אדום שאחרי קר נפשית מראש בכחול. יום אחד לאחר החשיפה NMDA קר נפשית מראש מראה יחסית ברמה "3" של פגיעה נ דמה ("5"), שליטה, עולה בקנה אחד עם neuroprotection 40%. עם זאת, אם הפורמט המסורתי באמצעות יחסי (כלומר, פגיעה / פציעה מקסימלי) משמש, הגנה לא ברור [קרי: (5 / 10) = 50% עבור זיוף נ '(3 / 6) = 50% עבור קר נפשית מראש ]. איור 4. Typial תוצאה qPCR מוצגים. עילית עקומת RNA עותק מספר נ 'מחזור סף הגברה PCR מראה שולטת (כחול) דגימות ניסיוני (אדום). התמונה התחתונה מראה פרופילים הגברה טיפוסי ארבע דגימות (שחור, ירוק, צהוב וסגול). שימו לב המחזורים האחרונים Ct הסף (מסומן בקו כתום) להתרחש 26.0, 29.5, 31.0 ו 32.5. איור 5. פעמיים תווית immunostaining השתמשו כדי לאשר qPCR והתוצאות qPCR מערך התרבות פרוסה היה מעובד עבור IL-11 (אדום) NeuN (ירוק, לציון נוירונים). לחקור את לוקוסים הביטוי התאי של IL-11. שימו לב כמה עצב פירמידליים (חיצים) להראות IL-11 ו מכתים NeuN (צהוב) בעוד כמה תאים קטנים (חיצים), חזקה כי האסטרוציטים, להראות גדל רק IL-11 צביעה (אדום).