Вертикальная съемка Drosophila Эмбрионы

1. Методология изображений Растопить желе глицерина в 55 ° C степень водяной бане в течение 20-30 минут, пока она не станет однородной жидкости. Swirl, но не трясите бутылку, чтобы избежать образования пузырьков. В то время как желе расплавов, нанесите тонкий слой глицерина использованием Kimwipe на чистую предметное стекло (опционально). Внесите 1 до 1,5 мл расплавленного глицерин желе с помощью пипетки сократить P1000 наконечник на поверхность слайд, чтобы создать тонкий первый слой. Внесите тщательно, чтобы избежать пузырей. Пусть желе укрепить в течение 5 мин на горизонтальной поверхности, затем поместить слайд при температуре -20 ° С в течение 5 мин и приступить к эмбрион выравнивания. Кроме того, крышка слайд с Саран Wrap и поместить его на 4 ° С в течение 5 дней. Внесите небольшую каплю окрашенных эмбрионов в 70% глицерине / PBS или другими antifade на основе глицерина монтажа средств массовой информации (например, Slowfade или Vectashield) на стороне кровати желе. Начало предварительно выравнивания эмбрионов индивидуально переводя их из выпадающего на поверхность желе. Передача их с помощью наклонной иглы для подкожных инъекций, использованием наклонной стороне ложки. Грубо место эмбрионов вдоль 2 до 3 колонки. Если эмбрион застревает в иглу, размешайте его в раскрывающемся содержащие других эмбрионов, чтобы освободить его. Не тратьте время тщательно выравнивая их в этой точке. Оставьте немного пространства между колоннами. Совместите эмбрионов, сдвинув их по горизонтали на среду желе с помощью шприца. Хотя раздвижные, ориентироваться головы и хвосты в том же направлении. Сделать их параллельно друг другу вдоль колонны. Удалите излишки глицерина PBS слева, как тропа с кусок витой Kimiwipe. Примечание: Превышение глицерина вызовет эмбрионы должны быть свободно заключенная в гель, в результате разделения двух слоев желе, что затрудняет резать и монтировать. И наоборот, удаляя слишком много глицерина будет сухой и придавить эмбрионов. Используйте сократить желтый наконечник распространяться тонкий слой желе над эмбрионами (50-150 мкл, в зависимости от того, сколько были приведены в соответствие). Место слайда в морозильной камере -20 ° С в течение 10-20 мин или хранить его при температуре 4 ° С в течение ночи. Убедитесь в том, желе полностью жесткой перед сокращением. В противном случае блок эмбрионов будет очень трудно акциза. Наилучшие результаты для резки получены на следующий день. Под рассекает области, следует использовать лезвие, чтобы вырезать полностью через желе с обеих сторон выравниваются эмбрионов. Держите лезвие на 90 градусов, чтобы сделать прямые пропилы. Сокращения должны быть сделаны в непосредственной близости от переднего и заднего полюса эмбрионов, чтобы избежать избыточного желе, которые могут препятствовать визуализации. Добавить 100-200 мкл холодного PBT (4 ° С, PBS, 0,1% Твин-20) рядом с порезами и аккуратно соскоблить желе между эмбрионами с помощью шпателя. Примечание: моющее средство в PBT помогает удаление желе из слайдов без повреждения эмбрионов. Использование иглу, передача блока желе со встроенным эмбрионов на чистую слайд для дальнейшей резки. Вырезать мелкие блоки с 5-7 эмбрионов. Используйте PBT легко перемещать вокруг блока желе. Кроме того, место блока на сухую поверхность стекла, чтобы позволить этому придают стекла, что создает большую устойчивость именно для отделки желе, если это необходимо. Отразить вертикально эмбрионов встроенные в желе с помощью лезвия бритвы и иглы. Для визуализации под микроскопом, осуществляться на основе либо один из двух шагов ниже, в зависимости от типа микроскоп стенда используется. Инвертированный микроскоп: место готовых эмбриона блоков на долгое покровное, с эмбрионами в вертикальном положении. Убедитесь, что сторона эмбриона с наименьшим количеством желе будет находиться в более тесном контакте с целью. Вертикальный микроскоп: сделайте две стопки с четырьмя # 1 покровные склеенных суперклеем для использования в качестве "поддерживает" и место эмбриона блока в глицерина между "поддерживает". Мост стеки с помощью длинного покровного. Для конфокальной анализ, проверить рабочее расстояние цели, которые будут использоваться, чтобы узнать, можно ли изображение весь путь до конца эмбриона или только частично. Например, Д. MELANOGASTER эмбрионы ~ 0,55 мм в длину и может быть полностью отображаемого использованием Zeiss 20x План-Апо или 40x LD Нео-Fluor цели. Следующие веб-сайт содержит информацию об имеющихся целей Zeiss и дает вам возможность поиска целей в соответствии с рабочим расстоянием: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2. Представитель Результаты Поскольку эмбрионы остаются нетронутыми, этот метод может использоваться, чтобы взять точные измерения размера эмбриона и расстояния между паттернами экспрессии генов. На рисунке 1, мы показываем бластодерма стадии эмбрионов окрашивали ядерным пятно DAPI (синий), анти-Спинной белка (красный), SOG мРНК (желтый) и СНС мРНК (зеленый). Морфологические процессорыСЭС, таких как инвагинации мезодермы (рис. 2а, б) и миграции мезодермального клетки (рис. 3 и 4) также могут быть визуализированы с помощью этого метода. Различные Z-позиции вдоль оси Д. В. может быть получен путем изменения фокальной плоскости, как показано на рисунках 2-4. Рисунок 1. Вертикальный оптический кусочек нетронутой эмбриона в стадии бластодермы. Двойное окрашивание на мРНК и белка. Целевая мРНК на месте зонды (SOG и СНС) и белка окрашивали первичного антитела (анти-Спинной) указаны на рисунке. DAPI был использован для обозначения ядер. Обратите внимание, что выражение SOG и СНС расположены вершиной в цитоплазме, в то время как выражение Спинной ядерный. Сильные сигналы от SOG зарождающейся стенограмм, которые расположены в ядрах можно также рассматривать в этом увеличении. Рисунок 2. Вертикальная съемка нетронутыми gastrulating эмбриона. Зондов мРНК использовали и их цвета указаны на рисунке. ) Отметим, что на этой стадии, три гена, окрашивали же фтор (СНС, SOG и DPP, в зеленый цвет), выражаются в пространственно разделенных областях. Инвагинирующий мезодермы выражает СНС, нейробластов слоя выражает инд и эктодермы выражает DPP, а SOG выражении все еще ​​присутствует в вентральной области нервной системы. Б) В глубоком конфокальной плоскости того же зародыша, отметим, база инвагинирующий мезодермы сильно выражает СНС, но его апикальной области выражает более низких уровнях. Рисунок 3. Вертикальная съемка нетронутыми эмбрион зародыш группу расширенного SOG РНК (желтый);. Улитка, инд и DPP мРНК (зеленый), Спинной белка (красный). Ядра окрашивали DAPI (синий). А) в фокальной плоскости вблизи эмбриона голову. B) Другой фокальной плоскости в багажнике области же эмбриона. Обратите внимание, масса мезодермального клетки до латеральной миграции (сравните с рис 4) плотно прилегающая к вентральной срединной линии по обе стороны зародышевой группа расширенной эмбриона. Расслоения нейробластов помечены зеленым цветом (инд и СНС). Рисунок 4. Вертикальная съемка нетронутыми эмбриона во время зародыш расширение группы SOG РНК (желтый);. Улитка, инд и DPP мРНК (зеленый), Спинной белка (красный). А) Примечание расслоения нейробластов из эпителия (стрелка), витражи, как для инд и СНС на данном этапе (зеленый). Отметим также ограничено выражением SOG на вентральной срединной линии (желтый). Выражение DPP на данном этапе можно увидеть на боковых сторон эмбриона (звездочка). B) Оптический раздел в том же эмбриона показано в конце эмбриона длиной, которая соответствует середине задней области. Вентральной срединной клетки окрашиваются для SOG.