の直立イメージングショウジョウバエ胚

1。イメージング手法それが均一に液体になるまで20〜30分55℃程度の水浴中にゼリーグリセリンを溶かす。渦巻が、気泡の形成を避けるために、ボトルを振っていない。 ゼリーが溶けている間、きれいなガラススライド（オプション）にキムワイプを用いてグリセロールの薄層を適用する。 薄い最初のレイヤーを作成するスライドの表面上にカットP1000ピペットチップを使用してゼリー溶けたグリセリンのピペット1から1.5 mLの。泡を避けるために慎重にピペット。 ゼリーは、水平面上で5分間、その後5分間-20℃でスライドを配置し、胚の整列に進みます固化してみましょう。また、サランラップでスライドをカバーし、最大5日間4℃に置きます。 ゼリーの寝具の側に70％グリセロール/ PBSまたは他の退色グリセロールベースマウントメディア（例えばSlowfadeまたはVectashield）で染色した胚の小滴をピペット。 個別にゼリーの表面にドロップダウンリストから、それらを転送することによって胚を事前に合わせ始める。スプーンのように傾斜した面を使用して、斜めの皮下注射針を使用してそれらを転送します。 およそ2から3列に沿って胚を置く。胚を針に陥っている場合、それを解放するために、他の胚を含むドロップダウンでそれをかき混ぜる。慎重にこの時点でそれらを合わせて時間を無駄にしないでください。列の間にスペースを残す。 皮下注射針の助けを借りて、ゼリーの培地上に水平にスライドするだけで胚の位置を合わせます。一方、スライド、向きが同じ方向に頭と尾。列に沿って互いにそれらを平行にしてください。ツイストペアKimiwipeの切れ端で証跡として残すPBSのグリセロールの過剰を削除します。 注：過剰なグリセロールは難しいカットしてマウントすること、二つのゼリー層の分離の結果、胚がゲル内に緩く包むべきものになります。逆に、あまりにも多くのグリセロールを削除すると、乾燥や胚を平らになります。 胚（50〜150μL、整列された数に応じて）上のゼリーの薄層を広げるためにカット黄色の先端を使用してください。 場所の10〜20分間、-20℃の冷凍庫でスライドまたは4℃で一晩保管してください。ゼリーはカットする前に完全に剛性であることを確認します。それ以外の場合、胚のブロックは、物品税が非常に困難になります。最先端で最良の結果は、次の日に取得されます。 解剖スコープで、整列胚の両側にゼリーを介して完全にカットするためにカミソリの刃を使用してください。ストレートカットを作るために90 °の角度でカミソリの刃を保持する。カットは、撮影の妨げになる余分なゼリーを避けるために、胚の前部と後部の極に非常に近いなされるべきである。 カットの隣に冷たいPBT 100〜200μL（4℃、PBS +0.1％Tween20を）追加し、慎重にスパチュラを用いて胚の間にゼリーを削り取る。 注：PBTの洗剤は、胚を損傷することなく、スライドからゼリーの除去に役立ちます。 針を使用して、さらに加工するためのクリーンなスライドに埋め込まれた胚とゼリーのブロックを転送する。 5月7日胚で小さなブロックをカット。簡単にゼリーのブロックを移動するPBTを使用してください。また、それは必要に応じて正確に、ゼリーをトリミングするための、より安定性を作成するガラス、に接続できるように乾燥したガラスの表面にブロックを設置。 かみそりの刃と針の助けを借りてゼリーに埋め込まれた直立胚を反転します。顕微鏡下で可視化のために、使用されているスタンド顕微鏡の種類に応じて、以下の2つの手順のいずれかに進みます。 倒立顕微鏡：場所は直立の位置に胚を、長いカバースリップの上に胚のブロックを終了する。ゼリーの最低額と胚の側は客観的との緊密な接触になることを確認してください。 正立顕微鏡："サポートする"として使用されると、"サポートする"との間にグリセロールの胚のブロックを配置するために瞬間接着剤で接着4本の＃1カバーグラスで2つのスタックを作る。長いカバースリップを使用してスタックを埋める。 共焦点分析のために、あなたが画像のすべての方法を胚を介して、または部分的にしか処理できるかどうかを調べるために使用される目的の作動距離を確認してください。たとえば、D.キイロ胚の長さは〜0.55 mmを持っていると完全にツァイス20倍プランアポまたは40倍LDネオフルーアの対物レンズを用いて画像化することができます。次のWebサイトは、利用可能なツァイスの目標に関する情報を持って、あなたの作動距離に応じて目標を検索するオプションを与える：https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.phpを 2。代表的な結果胚はそのまま残っているので、この方法は、胚のサイズと遺伝子発現パターン間の距離の正確な測定を行うために使用することができます。図1では、我々は核 ​​染色DAPI（青）、抗背タンパク質（赤）、SOGのmRNA（黄色）とSNAのmRNA（緑）で染色した胚盤葉期胚を示しています。形態学的プロセッSES、中胚葉の陥入（図2A、B）と中胚葉細胞（図3と4）の移行などもこの方法を使用して視覚化することができます。 DVの軸に沿って異なるZ -位置は、図2-4に示すように、焦点面を変更することにより得ることができます。 図1。胚盤葉の段階で無傷の胚の直立光学スライス。mRNAとタンパク質のための二重染色。 situプローブの（SOGとSNA）と一次抗体（抗背側）で染色したタンパク質の標的mRNAは、図に示されている。 DAPIは核を標識するために使用されていました。背の発現は核でありながら、SOGとSNAの発現は、細胞質内にapically配置されていることに注意してください。核に位置してSOGの新生転写物からの強い信号はまた、この倍率で見ることができます。 図2。無傷gastrulating胚の直立像。mRNAのプローブは、使用されており、それぞれの色が図に示されている。 A）、（SNA、緑のSOGとDPP、）、、この段階では同じフッ素で染色された3つの遺伝子を注意して空間的に分離されたドメインで表されます。 invaginating中胚葉は、SNAを表現する、神経芽細胞層はINDを表現し、SOGの表現はまだ神経系の腹側の領域に存在している間、外胚葉は、DPPを表現しています。 B）同じ胚の深い焦点面では、我々は強くSNAを表現invaginating中胚葉の基底に注意してください、しかし、その先端部は、低いレベルを表している。 図3。 。 カタツムリ、INDとDPPのmRNA（緑）、背側蛋白質（赤）、 胚芽のバンドとそのまま胚の直立像は、SOG RNA（黄色）を拡張 。核はDAPI（青）で染色した。胚の頭部に近いA）フォーカルプレーン。同じ胚のトランクの地域でのB）もう一つの焦点面。横方向の移行が（図4を比較）の胚帯の拡張胚の両側に腹側正中線に近い嘘前に中胚葉細胞の質量に注意してください。剥離神経芽細胞は、緑色（INDおよびSNA）のラベルが付いています。 図4。胚帯の拡張時に無傷の胚の直立像 SOG RNA（黄色）、。 カタツムリ、INDとDPPのmRNA（緑）、背側蛋白質（赤）。 A）上皮（矢印）から剥離神経芽細胞（注）、（緑）この段階ではINDとSNAの両方を染色した。 SOGの制限された発現は腹側正中（黄色）にも注意してください。この段階でDPPの発現は、胚の側面（アスタリスク）で見ることができます。 B）同じ胚の光学セクションでは、半ば後方部に相当する胚の長さ、の終わり近くに示します。腹側正中の細胞は、SOGのために染色されています。