Upright Imaging von Drosophila Embryos

1. Imaging-Methodik Melt Glyzerin-Gelatine in einem 55 ° C Grad Wasserbad für 20-30 Minuten, bis es eine homogene Flüssigkeit wird. Swirl, aber nicht die Flasche schütteln, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Während das Gelee schmilzt, eine dünne Schicht von Glycerin mit einem Kimwipe auf einen sauberen Glasobjektträger (optional). Pipette 1 bis 1,5 ml geschmolzenem Glyzerin-Gelatine mit einem Schnitt P1000 Pipettenspitze auf der Oberfläche der Folie, um eine dünne erste Schicht zu erzeugen. Pipette vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Lassen Sie das Gelee erstarren für 5 min auf einer horizontalen Fläche, dann die Folie bei -20 ° C für 5 min und fahren Sie mit Embryo Ausrichtung. Alternativ Abdeckung der Folie mit Saran Wrap und legen Sie sie bei 4 ° C für bis zu 5 Tage. Pipette einen kleinen Tropfen gefärbten Embryonen in 70% Glycerin / PBS oder andere Antifade Glycerin-Basis Montage Medien (zB Slowfade oder Vectashield) auf der Seite des Gelee Betten. Begin pre-Ausrichtung der Embryonen, die durch individuell ihre Übertragung aus dem Drop auf das Gelee Oberfläche. Übertragen Sie sie mit einer schrägen Injektionsnadel, mit dem schrägen Seite wie ein Löffel. Rund Ort des Embryos entlang von 2 bis 3 Spalten. Wenn ein Embryo in die Nadel stecken bleibt, rühren Sie ihn in der Dropdown mit den anderen Embryonen, um sie freizugeben. Verschwenden Sie keine Zeit sorgfältig richtet sie an dieser Stelle. Lassen Sie etwas Platz zwischen den Spalten. Richten Sie die Embryonen, indem sie horizontal auf dem Gelee Medium mit Hilfe der Injektionsnadel. Während Sie, richten Sie die Köpfe und Schwänze in die gleiche Richtung. Machen Sie sie parallel zueinander entlang der Spalte. Entfernen Sie überschüssiges PBS Glycerin als einen Weg mit einem Stück gedreht Kimiwipe links. Hinweis: Überschüssige Glycerin verursacht Embryonen zu locker eingeschlossen in Gel, wodurch die Trennung der beiden Gelee Schichten, so dass es schwierig zu schneiden und zu montieren. Umgekehrt wird das Entfernen zu viel Glycerin trocken und flach Embryonen. Verwenden Sie einen Schnitt gelber Spitze, eine dünne Schicht von Gelee über die Embryonen (50-150 ul, je nachdem wie viele ausgerichtet wurden) zu verbreiten. Legen Sie gleiten in -20 ° C Gefrierschrank für 10-20 min oder lagern Sie es bei 4 ° C über Nacht. Stellen Sie sicher, das Gelee ist völlig starr vor dem Schneiden. Andernfalls wird der Block von Embryonen sehr schwierig sein, Verbrauchsteuern. Die besten Ergebnisse für das Schneiden sind am nächsten Tag erhalten. Unter einem Binokular, verwenden Sie eine Rasierklinge vollständig durchschnitten das Gelee auf beiden Seiten der ausgerichteten Embryonen. Halten Sie die Rasierklinge in einem 90 ° Winkel gerade Schnitte zu machen. Die Schnitte sollten sehr nahe an den vorderen und hinteren Pole des Embryos in der Nähe, um überschüssige Gelee, das Bildgebung behindern könnten vermieden werden. 100-200 ul kalter PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) neben der Schnitte und sorgfältig abkratzen das Gelee zwischen Embryonen mit einem Spatel. Hinweis: Das Waschmittel in PBT hilft das Entfernen des Gelee aus der Folie ohne Beschädigung des Embryos. Mit einer Nadel, übertragen Sie die Block-Gelee mit eingebetteten Embryonen zu einem sauberen Objektträger zur weiteren Schnitt. Cut kleinere Blöcke mit 5-7 Embryos. Verwenden Sie PBT, um leicht die Gelee-Block zu bewegen. Alternativ, setzen Sie den Block auf einer trockenen Glasoberfläche zu lassen, um das Glas, das mehr Stabilität für präzise Beschneiden der Gelee, wenn nötig schafft befestigen. Flip aufrechte die Embryonen in die Gelee mit Hilfe einer Rasierklinge und einer Nadel eingebettet. Für die Visualisierung unter dem Mikroskop, die entweder mit einem der beiden unten angegebenen Schritte aus, abhängig von der Art des Stativs verwendet wird. Inversen Mikroskop: Platz beendete Embryo Blöcke auf einen langen Deckglas mit Embryonen in eine aufrechte Position. Stellen Sie sicher, dass die Seite des Embryos mit der geringsten Menge von Gelee wird in engeren Kontakt mit Ziel sein. Aufrechten Mikroskop: make zwei Stapel mit vier Nr. 1 Deckgläser mit Sekundenkleber verklebt als "unterstützt" verwendet werden und statt der Embryo-Block in Glycerin zwischen den "unterstützt". Brücke der Stapel mit einem langen Deckglas. Für konfokale Analyse, Überprüfung der Arbeitsabstand der Ziele, die verwendet werden, um herauszufinden, ob man sich vorstellen kann den ganzen Weg durch den Embryo oder nur teilweise. Zum Beispiel, D. melanogaster Embryonen ~ 0,55 mm in der Länge und kann vollständig abgebildet werden mit Hilfe eines Zeiss 20x Plan-Apo oder 40x LD Neo-Fluor Ziel. Die folgende Website bietet Informationen zu verfügbaren Zeiss Ziele und gibt Ihnen die Möglichkeit, Ziele nach Arbeitsabstände Suche: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2. Repräsentative Ergebnisse Da die Embryonen links intakt sind, kann diese Methode verwendet, um präzise Messungen der Embryo Größe und Abstände zwischen Genexpressionsmuster ergreifen. In Abbildung 1 zeigen wir eine Blastodermstadium Embryonen mit der Kernfärbung DAPI (blau), Anti-Dorsal-Protein (rot), sog mRNA (gelb) und sna mRNA (grün) gefärbt. Morphologische Verarbeitungses kann wie Invagination des Mesoderms (Abb. 2A, B) und die Migration von mesodermalen Zellen (Abb. 3 und 4) visualisiert werden mit dieser Methode. Verschiedene Z-Positionen entlang der DV-Achse kann durch Änderung der Fokusebene erhalten werden, wie in den Abbildungen 2-4 dargestellt. Abbildung 1. Upright optische Scheibe eines intakten Embryos in Blastodermstadium. Doppelfärbung für mRNA und Protein. Ziel-mRNAs für in situ Sonden (sog und SNA) und Protein, das von primärer Antikörper (anti-Dorsal) gefärbt sind in der Figur angedeutet. DAPI wurde verwendet, um die Kerne Etikett. Beachten Sie, dass die Expression des sog und sna apikal sind im Zytoplasma lokalisiert, während die Expression von Dorsal ist die Kernkraft. Starke Signale aus sog entstehenden Transkripte, die in den Kernen liegen auch bei dieser Vergrößerung zu sehen. Abbildung 2. Upright Bildgebung von einer intakten gastrulating Embryo. MRNA-Sonden verwendet werden und ihre jeweiligen Farben sind in der Figur angedeutet. A) Beachten Sie, dass in dieser Phase drei Gene mit gleicher Fluor (SNA, sog und dpp, in grün), gefärbt sind in räumlich getrennten Bereichen zum Ausdruck gebracht. Die einstülpende Mesoderm drückt sna, drückt die Neuroblasten Schicht ind und dem Ektoderm drückt dpp, während sog Ausdruck ist noch im ventralen Regionen des Nervensystems. B) In einem tieferen konfokalen Ebene des gleichen Embryos, bemerken wir die Basis des einstülpende Mesoderm stark drückt sna, aber die apikale Region drückt unteren Ebenen. Abbildung 3. Upright Bildgebung von einer intakten Embryo mit Keimstreifs erweitert sog RNA (gelb);. Schnecke, ind und dpp mRNAs (grün), Dorsal-Protein (rot). Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. A) Focal-plane in der Nähe Embryo Kopf. B) Ein weiterer Schwerpunkt Flugzeug in den Kofferraum Region gleichen Embryos. Hinweis Masse von Mesodermzellen vor seitlichen Migration (vgl. Abbildung 4) liegen in der Nähe der ventralen Mittellinie auf beiden Seiten ein Keim-Band erweitert Embryo. Delaminierenden Neuroblasten sind in grün (ind und SNA) gekennzeichnet. Abbildung 4. Upright Bildgebung von einer intakten Embryo während Keimstreifs Erweiterung sog RNA (gelb);. Schnecke, ind und dpp mRNAs (grün), Dorsal-Protein (rot). A) Man beachte die Delamination Neuroblasten aus dem Epithel (Pfeil), gebeizt sowohl für ind und sna in dieser Phase (grün). Beachten Sie auch die beschränkte Expression von sog an der ventralen Mittellinie (gelb). Expression von dpp in diesem Stadium kann bei der lateralen Seite des Embryos (Stern) zu sehen. B) Optische Abschnitt in der gleichen Embryo in A am Ende des Embryos Länge, die bis Mitte hinteren Bereich entspricht gezeigt. Die ventralen Mittellinie Zellen sind für die sog gefärbt.