인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

1. 마우스에서 수확 Xenografts Dulbecco의 수정된 이글 중간 (DMEM) 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 페니실린 – 스트렙토 마이신, 200 U / ML Collagenase 종류 IV, 그리고 0.6 U / ML dispase와 함께 보충 : 세포 분리 버퍼를 준비합니다. 가장 큰 지름 1cm 미만입니다 피하 인간의 췌장암의 이종 이식을 품고 athymic (뉴 + / 뉴 +) 마우스는 이산화탄소 질식 및 경추 전위에 의해 euthanized있다. 피하 종양은 집게와 가위를 사용 무딘 절개로 마우스의 측면에서 수확하고 세포 분리 버퍼에 즉시 배치됩니다. 종양은 무게와 종양 조직 1g 당 10 ML 세포 분리 버퍼에 다시 배치됩니다. 2. Xenografts에서 단일 셀 서스펜션을 생성 멸균 biosafety 캐비닛에 근무, 종양 세포 분리 버퍼 1 ML과 100 X 20mm 문화 요리로 전송됩니다. 종양은 기계 살균 면도날과 집게를 사용하여 다진 있습니다. 종양 세포 현탁액은 5 ML serological pipet을 통해 10 번 triturated입니다. 종양 조각은 5 ML serological pipet을 방해할하지 않을 정도로해야합니다. 종양 세포 현탁액이 세포 분리 버퍼의 나머지 볼륨 (50 % 미만 가득)가 포함된 50 ML 원뿔 관에 전송하고 1 분 최대 속도 vortexed입니다. 종양 세포 현탁액은 다음 ° C 2 시간 일분 매 20 분 동안 간헐적으로 vortexing와 함께 37 incubated입니다. 3. 세포 조직 파편의 서스펜션과 죽은 세포를 고갈 2 시간 배양 후 세포 현탁액은 1 분 최대 속도 vortexed입니다. 세포 현탁액은 다음 70 μm의 필터를 통과하고 신선한 50 ML 원뿔 튜브의 수집 관 당 15 ML의 최종 볼륨으로 조정됩니다. 죽은 세포 및 조직의 잔해로부터 더욱 분리 가능한 세포, 종양 세포 현탁액은 Ficoll – Paque 플러스를 사용하여 밀도 원심 분리로 구분됩니다. Ficoll – Paque 플러스의 underlayment는 플러스 천천히 두 레이어를 혼합하지 않도록주의되는 세포 현탁액 아래 Ficoll – Paque 15 ML을 pipeting에 의해 생성됩니다. 세포 현탁액과 Ficoll 레이어는 브레이크와 함께 30 분 동안 500x g에 centrifuged집니다 것은 해제. Ficoll – Paque 플러스 및 세포 분리 버퍼의 인터페이스에서 전지 수집 신선한 50 ML 원뿔 튜브로 전송됩니다. 신선한 DMEM 10 % FCS와 함께 보충 것은 그것을 희석하기 위해 세포 현탁액에 추가됩니다 1시 3분 (예 : 20 ML 신선한 미디어 세포 현탁액의 10 ML에 추가). 세포는 10 분 decanted 미디어 450x g에서 원심 분리하여 수집하고 있으며, 세포 펠렛은 ALDEFLUOR 버퍼 1 ML에 resuspended 있습니다. 세포 현탁액의 열 microliters 10 μL trypan 파랑, 가능한 세포를 hemocytometer를 사용하여 계산됩니다와 희석 수 있습니다. 죽은 세포 또는 조직 파편 많은이 단계에서 언급하는 경우에는 다음 밀도 원심 분리하여 세포 분리는 (- 3.7 단계 3.3) 반복 수 있습니다. 4. 형광 활성 세포 정렬에 대한 세포를 얼룩 로 분류 일곱 12 X 75mm의 폴리스티렌 테스트 튜브는 다음과 같습니다 흠없는 CD44 – APC CD24 – PE 마우스 CD31 – 비오틴 + 마우스 혈통 – 비오틴 + 마우스 H – 2Kd – 비오틴 ALDEFLUOR ALDEFLUOR + DEAB + IgG 2bκ – APC + IgG 2aκ – PE ALDEFLUOR + CD44 – APC + CD24 – PE + 마우스 CD31 – 비오틴 + 마우스 혈통 – 비오틴 + 마우스 H – 2Kd – 비오틴. 만 5-10 셀 / ML의 최종 농도 ALDEFLUOR 버퍼 2 ML에 세포 현탁액을 희석하여 얼음 계속. 튜브 # 1, 2, 3, 4에 세포 현탁액을 100 μL를 추가하고 얼음에 있습니다. 튜브 # 6-1 μL DEAB를 추가하고 얼음 계속. 1000 희석 나머지 세포 현탁액에 ALDEFLUOR 시약 추가 – 접어 (예 : 1.6 ML의 세포 현탁액을 1.6 μL ALDEFLUOR 시약 추가) 잘 혼합하고, 얼음에 놓으십시오. 튜브 # 7-100 튜브 # 5와 6이 혼합물 μL, 나머지 혼합물 (1.4 ML)를 전송합니다. 40 분 37 ° C 물 목욕에있는 튜브를 모두 품어. 튜브의 바닥에 정착에서 세포를 방지하기 위해 세포 현탁액마다 10 분 정도 섞는다. 450x g에서 세포와 4 원심 분리기 ° C 10 분, 다음 버퍼를 가만히 따르다하십시오. 100 μL ALDEFLUOR 버퍼에 튜브 # 1 5 알약을 Resuspend. 튜브 # 2, 3, 4, 6하려면 다음과 같이 희석 적절한 항체를 포함하는 ALDEFLUOR 버퍼 100 μL를 추가 : IgG 2bΚ – APC, IgG 2aΚ – PE, CD44 – APC, 그리고 CD24 – PE에 대한 1시 20분항체, 마우스 CD31 – 비오틴에 대한 1:100, 마우스 혈통 – 비오틴, 마우스 H – 2Kd – 비오틴 항체. 튜브 위해 # 7은 1.4 CD44 – APC의 1시 20분 희석을 포함 ALDEFLUOR 버퍼의 ML, 그리고 CD24 – PE 항체와 마우스의 1:100 희석 CD31 – 비오틴을 추가, 마우스 혈통 – 비오틴, 마우스 H – 2Kd – 비오틴 항체. 10 분 얼음 셀 suspensions을 품어. 450x g에서 세포와 4 원심 분리기 ° C 10 분, 다음 버퍼를 가만히 따르다하십시오. 튜브 # 1, 2 산탄, 3, 5, 100 μL ALDEFLUOR 버퍼에서 6 Resuspend. streptavidin – PerCP 단백질의 1:100 희석을 포함 ALDEFLUOR 버퍼의 1.5 ML를 준비합니다. 튜브 # 4-100 μL를 추가하고 튜브 # 7-1.4 ML를 추가합니다. 10 분 얼음 셀 suspensions을 품어. 450x g에서 세포와 4 원심 분리기 ° C 10 분, 다음 버퍼를 가만히 따르다하십시오. 튜브 # 1, 2 산탄, 3, 4, 5, 200 μL ALDEFLUOR 버퍼에서 6 Resuspend. 2 μg / ML의 propidium 요오드화물을 포함하는 제품 ALDEFLUOR 버퍼의 2.8 ML에 튜브 # 7 펠렛을 Resuspend. 항상 얼음에 튜브 보관하십시오. 스트레이너 모자 12 X 75mm의 폴리스티렌 테스트 튜브를 사용하여 35 μm의 필터를 통해 세포를 전달합니다. 5. 형광 활성 세포별로 정렬 암 줄기 세포를 분리 FACSAria 흐름 cytometer은 세​​포 분류를위한 준비가되어 있습니다. 보정 컨트롤 튜브 # 1, 2, 3, 4, 5의 세포를 사용하여 설정됩니다. 게이츠는 셀 singlets를 수집 전달 및 사이드 산란 매개 변수를 기반으로 만들어집니다. 비 마우스 (PerCP – 음수)과 가능한 (비 propidium 요오드화물 얼룩) 세포는 FL – 3 채널을 사용하여 문이 있습니다. DEAB – 대우 전지 (튜브 # 6) 및 FL – 1 채널을 사용하여 만든 ALDH + 세포는 게이츠에 따라 수집하고 있습니다. CD44 + CD24 + 세포는 게이츠에 따라 수집하는 FL – 4 및 FL – 2 채널을 사용 ALDEFLUOR, IgG 2bΚ – APC 및 IgG 2aκ – PE (튜브 # 6) 물들일 세포를 사용하여 만들었습니다. 세포 10% FCS와 보충 DMEM 1 ML을 포함 12 X 75mm의 폴리스티렌 테스트 튜브에 수집하고 있습니다. 세포가 정렬되고 나면, 가만히 따르다 10 분 미디어 450x g에 세포 현탁액을 원심 분리기, 500 μL 신선한 DMEM에있는 세포를 resuspend 10% FCS와 함께 보충. 로 단계 3.8에 설명된 hemocytometer를 사용하여 정렬 세포의 수를 계산합니다. 6. 대표 결과 이 프로토콜은 ALDH + 및 CD44 + CD24 + 췌장 CSCs의 고립으로 이어질 것입니다. 마우스 파생 세포의 비율이 변수이지만, 우리는 대부분의 인간의 췌장 암 xenografts가 마우스 CD31을 사용하여 마우스 유래 세포, 마우스 가계 칵테일, 마우스 H – 2Kd 비오틴 – 복합 항체 (그림 1A 20-60 %를 포함하는 것으로 나타났습니다 ). 마찬가지로 다른 xenografts에서 각 CSC 인구의 빈도가 변수이지만, 일반적으로 우리는 전체 세포 인구 1-4 %가 ALDH + (그림 1B)이며 0.2-5 %가 CD44 + CD24 + (그림 1C) 것으로 나타났습니다. FACSAria 기계 카운트가 자주 인해 FACSAria 감지되지 않은 세포 입자에 정확 있기 때문에 우리는 정기적으로 수동으로 hemocytometer를 사용하여 정렬 셀을 계산합니다. 그림 1. 유동세포계측법의 줄거리는 췌장암의 이종 이식에서 특정 인구를 묘사. (A) FL – 3 채널에 적극적으로 얼룩 세포 (propidium 요오드화물은 +, 마우스 CD31 + 마우스 가계 +, 또는 마우스 H – 2Kd +)가 단 분리만큼 제외됩니다 가능한이 아닌 마우스 세포를 파생. (B) 인간의 췌장암의 이종 이식의 ALDH 활동은 ALDH1 억제제 diethylamino – benzaldehyde (DEAB)의 존재와 부재의 ALDEFLUOR 시약을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정되었다. 프레임 DEAB로 치료 세포를 기반으로 만든 후 세포 치료에 적용되었다 ALDH + 세포를 묘사 문을 나타냅니다. ALDH의 + 세포의 비율은 게이트에 표시됩니다. (C) CD44 + CD24 + 문이 ALDEFLUOR 물들일 세포를 기반으로 작성하고, IgG 2bκ – APC (CD44 – APC에 대한 isotypic 제어)과 IgG 2aκ – PE는 (CD24 – PE에 대한 isotypic 제어) 항체되었습니다. CD44 + CD24 + 세포의 비율은 게이트에 표시됩니다.