人胰腺癌移植瘤的干细胞的分离

1。收获从小鼠移植瘤准备细胞解离缓冲液：贝科的改良Eagle培养基（DMEM），辅以10％小牛血清（FCS），青霉素，链霉素，200 U / mL胶原酶IV型，和0.6 U / mL的dispase。 一个裸鼠（NU + / NU +）窝藏皮下人胰腺癌移植瘤，是最大的直径小于1厘米的鼠标是安乐死二氧化碳窒息和颈椎脱位。 皮下肿瘤是收获从鼠标的侧面使用镊子和剪刀钝清扫，放置在细胞分解缓冲区立即。 肿瘤称重，每1克肿瘤组织放入10 mL细胞解离缓冲。 2。生成的移植瘤单细胞悬液在无菌的生物安全柜的工作，肿瘤转移与细胞分离缓冲液1毫升100 × 20毫米培养皿。肿瘤是机械肉末用无菌刀片和镊子。通过5毫升血清吸管中的肿瘤细胞悬液磨碎10倍。肿瘤件应足够小，不堵塞5毫升血清吸管。 肿瘤细胞悬液转移到50 mL锥形管中的细胞分解缓冲区的剩余量（填补低于50％），并在1分钟的最大速度振荡。 肿瘤细胞悬液，然后在37℃2小时1分钟，每20分钟的间歇振荡。 3。消耗细胞悬浮组织碎片和死细胞 2小时孵化后的细胞悬液，振荡1分钟的最高速度。 细胞悬液，然后通过一个70微米的过滤器和收集在一个新的50 – mL锥形管和调整最终体积至15毫升每管。 为了进一步分离可行的细胞死亡的细胞和组织碎片，肿瘤细胞悬液密度使用聚蔗糖 – 帕确加离心分离。聚蔗糖 – 帕确加衬垫pipeting加上缓慢的单元格下方小心，不要混合两​​层悬挂15毫升的聚蔗糖 – 帕确。 细胞悬液和聚蔗糖层是在500X克离心30分钟，与刹车关闭。 聚蔗糖 – 帕确Plus和细胞解离缓冲接口的细胞被收集并转移到一个新的50 mL锥形管。 新鲜的DMEM含10％FCS的补充，加入细胞悬液稀释1:3（如20毫升新鲜媒体加入到10 ml的细胞悬液）。 细胞收集在450X克离心10分钟，倒出的媒体，和细胞沉淀重悬于1毫升ALDEFLUOR缓冲区。 10微升的细胞悬液稀释10μL，台盼蓝活细胞计数使用一个血球。如果在这一步中指出大量的死细胞或组织碎片，然后可重复细胞密度离心分离（步骤3.3 – 3.7）。 4。染色荧光激活细胞分选的单元格标签七个12 × 75毫米的聚苯乙烯试管作为如下： 不染 CD44 – APC CD24 – PE 小鼠CD31的抗生物素蛋白+鼠标沿袭-生物素+鼠标的H – 2Kd -生物素 ALDEFLUOR ALDEFLUOR + DEAB + IgG抗体2bκ- APC + IgG抗体2aκ聚乙烯 ALDEFLUOR + CD44 – APC + CD24 – PE +鼠标CD31的抗生物素蛋白+鼠标沿袭抗生物素蛋白+鼠标的H – 2Kd -生物素。 ALDEFLUOR缓冲区在2毫升细胞悬液稀释到终浓度为5-10万细胞/ mL，置于冰上。添加100μL的细胞悬液，以管＃1，2，3和4，并保持他们在冰上。添加1μL，DEAB＃6管，并保持在冰上。 ALDEFLUOR试剂加入到剩余的细胞悬液，稀释1000 – 倍（如添加1.6μLALDEFLUOR试剂1.6 mL细胞悬液），拌匀，并置于冰上。 100μL这种混合物管＃5和6，其余的混合物（1.4毫升）传输管＃7。在37℃水浴40分钟中孵育管。混合细胞悬液，每10分钟一班，以防止沉淀到管底部的细胞。 离心机450X克细胞和4 ° C下10分钟，然后倒出的缓冲区。重悬于100μLALDEFLUOR缓冲区管＃1和5的颗粒。要管＃2，3，4和6，添加100μLALDEFLUOR缓冲区包含如下稀释相应抗体，IgG 抗体 2bΚ- APC，IgG 抗体 2aΚ- PE，CD44 – APC和CD24 – PE： 1:20抗体; 1:100的小鼠CD31的抗生物素蛋白，鼠标沿袭抗生物素蛋白和鼠标的H – 2Kd生物素抗体。 7＃管加入1.4毫升的ALDEFLUOR含有CD44 – APC的1:20稀释的缓冲，CD24 – PE抗体和1:100稀释的小鼠CD31 -生物素，鼠标沿袭抗生物素蛋白，小鼠的H – 2Kd -生物素抗体。在冰上孵育10分钟的细胞悬液。 离心机450X克细胞和4 ° C下10分钟，然后倒出的缓冲区。重悬浮颗粒在管1＃，2，3，5，6和100μLALDEFLUOR缓冲区。准备1.5毫升含1:100稀释的链霉亲和PerCP蛋白ALDEFLUOR缓冲区。加入100μL＃4管，并加入1.4毫升管＃7。在冰上孵育10分钟的细胞悬液。 离心机450X克细胞和4 ° C下10分钟，然后倒出的缓冲区。重悬浮颗粒在管1＃，2，3，4，5，和6 200μLALDEFLUOR缓冲区。重悬在2.8毫升含有2μg/ mL的碘化丙啶ALDEFLUOR缓冲区＃7管沉淀。在任何时候都保持冰管。 通过使用12 × 75毫米的聚苯乙烯试管过滤器，过滤器盖35微米的细胞。 5。荧光激活细胞分选分离肿瘤干细胞一个FACSAria流式细胞仪细胞分选的准备。 补偿控制是从管＃1，2，3，4和5使用的细胞。 盖茨创建正向和侧面散射参数的基础上，收集细胞汗衫。 非滑鼠（PerCP负）和可行的（非碘化丙啶染色）细胞使用FL – 3通道的门控。 ALDH +细胞收集的基础上，盖茨创建使用DEAB处理的细胞（＃6管）和FL – 1通道。 CD44 + CD24 +细胞是基于对盖茨收集，使用与ALDEFLUOR，IgG 抗体 2bΚ- APC和IgG2aκ- PE（＃6管），染色细胞，使用FL – 4和FL – 2通道创建。 细胞收集在12 × 75毫米聚苯乙烯测试含有1毫升辅以10％FCS的DMEM管。 细胞已被排序后，离心10分钟，倒出媒体450X克细胞悬液，500μL新鲜的DMEM重悬细胞与10％FCS的补充。 计数排序使用在步骤3.8中所描述的血球细胞的数量。 6。代表性的成果该协议将导致ALDH +和CD44 + CD24 +胰腺癌社区体育的隔离。鼠源性细胞的比例是可变的，但我们发现，大多数人胰腺癌移植瘤包含20-60％的鼠源性细胞CD31的使用鼠标鼠标的血统鸡尾酒，和鼠标的H – 2Kd生物素标记的抗体（图1A ）。同样，每次从不同的异种移植的CSC的人口的频率是可变的，但一般我们发现，细胞总人口的1-4％是乙醛脱氢酶（图1B）和0.2-5％的CD44 + CD24 +（图1C）。 我们经常手动FACSAria机计数排序细胞使用血球计数，因为往往是由于不准确的FACSAria检测非细胞颗粒的。 图1。流式细胞仪的情节描绘从胰腺癌移植瘤的特定人群（一）积极在FL – 3通道的细胞染色（ 碘化丙啶+鼠标CD31 +鼠标沿袭+或小鼠的H – 2Kd）被排除在外，以便隔离只可行的和非鼠源性细胞。 （二）在人胰腺癌移植瘤的乙醛脱氢酶活动ALDEFLUOR试剂ALDH1抑制剂二乙氨基苯甲醛（DEAB）的存在和缺乏流动使用流式细胞仪测定。帧代表盖茨描绘ALDH +已创建的基础上与DEAB处理的细胞，然后用于未经处理的细胞的细胞。 ALDH +细胞的百分比显示在门上。 （三）CD44 + CD24 +门是创建的基础上与ALDEFLUOR染色的细胞，IgG 抗体 2bκ- APC（CD44 – APC的isotypic控制）和IgG2aκ- PE（CD24 – PE isotypic控制）抗体。 CD44 + CD24 +细胞的百分比显示在门上。