ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

1。マウスから収穫の異種移植ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン – ストレプトマイシン、200 U / mLのコラゲナーゼIV型、および0.6 U / mLのディスパーゼを添加した：細胞解離バッファーを準備します。 最大直径1cm未満である皮下ヒト膵臓癌異種移植を保有する無胸腺（NU + / NU +）マウスは、二酸化炭素の窒息と頸椎脱臼により安楽死させています。 皮下腫瘍は​​、鉗子とハサミを用いて鈍的切開によってマウスの脇腹から採取し、細胞解離緩衝液中で直後に配置されます。 腫瘍の重量を測定し、腫瘍組織の1グラムあたり10 mLの細胞解離バッファーに戻されている。 2。異種移植片からの単一細胞懸濁液を生成する無菌バイオセーフティーキャビネットでの作業、腫瘍は細胞解離緩衝液1 mLと100 × 20 ​​mmの培養皿に転送されます。腫瘍は、機械的に無菌のかみそりの刃やピンセットを使って刻まれている。腫瘍細胞懸濁液を5 mLの血清学的ピペットを通して10回トリチュレートしています。腫瘍の部分は、5 mLの血清学的ピペットを詰まらせないために十分小さくする必要があります。 腫瘍細胞懸濁液は、細胞解離バッファー（塗りつぶされた50％未満）の残りのボリュームを含む50 mLコニカルチューブに移し、1分間最大速度でボルテックスしています。 腫瘍細胞懸濁液は、℃で2時間1分毎に20分間断続的にボルテックスしながら37℃でインキュベートされる。 3。組織破片及び死細胞の細胞懸濁液を使い果たす 2時間のインキュベーション後に細胞懸濁液は、1分間の最大速度でボルテックスしています。 細胞懸濁液を70μmのフィルターを通し、新鮮な50 mLコニカルチューブに回収し、チューブ当たり15 mlの最終量に調整されます。 死んだ細胞や組織の残骸からさらに別の生細胞に、腫瘍細胞懸濁液をFicoll – Paque Plusを使用して密度遠心分離によって分離される。をFicoll – Paqueプラスの下敷きは、プラス徐々に二つの層を混在しないように注意して細胞懸濁液の下をFicoll – Paque 15mLをペッティングすることによって作成されます。 ブレーキをオフにして細胞懸濁液とフィコール層は30分間500分の1 gで遠心分離されています。 をFicoll – Paqueプラスと細胞解離バッファーの界面で細胞を回収し、新鮮な50 mLコニカルチューブに移しています。 新鮮なDMEMに10％FCSを添加することは、それを希釈するために細胞懸濁液に添加される1:3（例：20mLの新鮮な培地は、細胞懸濁液を10mLに追加された）。 細胞を10分間、450 gで遠心分離によって収集され、メディアはデカントし、細胞ペレットは、ALDEFLUOR緩衝液1 mLに再懸濁する。 細胞懸濁液10μlを10μLトリパンブルーと生細胞血球計数器を使用してカウントしているで希釈する。死んだ細胞や組織の破片が多数このステップ中に明記されている場合は、密度遠心分離による細胞の分離は、（ – 3.7ステップ3.3）を繰り返すことができます。 4。蛍光活性化細胞選別のための細胞を染色としてラベルseven 12 × 75 mmのポリスチレン試験管は次のとおりです。 汚点のない CD44 – APC CD24 – PE マウスCD31 -ビオチン+マウス系統-ビオチン+マウスH – 2KD -ビオチン ALDEFLUOR ALDEFLUOR + DEAB + IgG抗体2bκ- APC + IgG抗体2aκ- PE ALDEFLUOR + CD44 – APC + CD24 – PE +マウスCD31 -ビオチン+マウス系統-ビオチン+マウスH – 2KD -ビオチン。 百万円50〜10細胞/ mLの最終濃度にALDEFLUORの緩衝液2 mLの細胞懸濁液を希釈し、氷上に置きます。チューブ＃1、2、3、および4に細胞懸濁液100μLを加え、氷上で保管して下さい。チューブ＃1〜6μLDEABを追加し、氷上に置きます。 1000希釈、残りの細胞懸濁液にALDEFLUOR試薬を追加 – 倍（例えば1.6 mLの細胞懸濁液1.6μLALDEFLUOR試薬を加える）、よく混ぜて、そして氷上に置きます。チューブ＃7に100チューブ＃5と6にこの混合物のμL、および残りの混合液（1.4 mL）を転送する。 40分37℃の水浴中でチューブのすべてをインキュベートする。チューブの底に沈降する細胞を防止するために細胞懸濁液は10分ごとに混ぜる。 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。 100μLALDEFLUORバッファー中で1位と5管でペレットを再懸濁します。チューブ＃2、3、4、および6に、次のように希釈し、適切な抗体を含むALDEFLUOR緩衝液100μLを追加します。IgG抗体2bΚ- APC、IgG抗体2aΚ- PE、CD44 – APC、およびCD24 – PEの1時20分抗体、マウスCD31 -ビオチン、マウス系統-ビオチン、およびマウスH – 2KD -ビオチン抗体の1:100。チューブ＃7を追加CD44 – APCの1:20希釈を含むALDEFLUORバッファー1.4 mLを加え、CD24 – PE抗体とマウスCD31 -ビオチン、マウス系統-ビオチン、およびマウスH – 2KD -ビオチンの1:100希釈へ抗体。 10分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートする。 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。チューブ＃1、2、3、5、および100μLALDEFLUORバッファ6にペレットを再懸濁します。ストレプトアビジン- PerCP蛋白質の100倍希釈液を含むALDEFLUORバッファーを1.5 mlを準備します。チューブに100μLを追加して＃4とチューブ＃7に1.4 mLを加える。 10分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートする。 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。チューブ＃1、2、3、4、5、および200μLALDEFLUORバッファ6にペレットを再懸濁します。濃度2μg/ mLのヨウ化プロピジウムを含むALDEFLUORバッファー2.8 mLのチューブ＃7でペレットを再懸濁する。すべての回でチューブを氷中に保管してください。 ストレーナーのキャップで12 × 75 mmのポリスチレン試験管を用いて35μmのフィルターを介して細胞を渡します。 5。蛍光活性化細胞選別により、がん幹細胞を分離 FACSAriaフローサイトメーターは、細胞選別のために準備されます。 補償のコントロールは、チューブ＃1、2、3、4、および5からセルを使用して設定されます。 ゲイツは、細胞のシングレットを収集するために前方および側散乱パラメータに基づいて作成されます。 非マウス（PerCP陰性）と実行可能な（非ヨウ化プロピジウムで染色）細胞は、FL – 3チャンネルを使用してゲートです。 DEAB処理した細胞（チューブ＃6）とFL – 1チャンネルを使用して作成されたALDH +細胞は、ゲートに基づいて収集されます。 CD44 + CD24 +細胞は、ゲートに基づいて収集されているFL – 4とFL – 2チャネルを使用してALDEFLUOR、IgG抗体2bΚ- APC、およびIgG2aκ- PE（チューブ＃6）で染色した細胞を使用して作成した。 細胞を10％FCSを補充したDMEM 1mLを含む12 × 75 mmのポリスチレン試験管に集められています。 細胞がソートされた後、デカント10分、メディアのために450 gで細胞懸濁液を遠心し、500μLの新しいDMEMに懸濁し、10％FCSを補充した。 としてステップ3.8節血球計数器を用いて選別された細胞の数を数えます。 6。代表的な結果このプロトコルは、ALDH +とCD44 + CD24 +膵臓のCSCの分離につながる。マウス由来の細胞の割合は可変ですが、我々は、ほとんどのヒト膵臓癌の異種移植片は、マウスCD31を用いて、マウス由来の細胞、マウスの系統のカクテル、そしてマウスH – 2KDビオチン標識抗体（図1A 20〜60％が含まれていることを見出した）。同様に異なる異種移植片から各CSCの人口の周波数は可変であるが、一般的に我々は、総細胞集団の1-4％がALDH +（図1B）であり、0.2から5パーセントは、CD44 + CD24 +（図1C）であることを見出した。 FACSAriaのマシンの数がしばしば原因FACSAriaによって検出される非細胞性粒子に不正確なので、我々は日常的に手動で血球計数器を使用してソートされた細胞を数える。 図1。膵臓癌の異種移植片からの特定の集団を描いた、フローサイトメトリープロット。（）FL – 3チャネル（ヨウ化プロピジウム+、マウスCD31 +マウスの系統+、またはマウスH – 2KD +）に積極的に染色細胞は分離するように除外されています実行可​​能と非マウス由来の細胞。 （B）ヒト膵臓癌異種移植におけるALDH活性はALDH1の阻害剤ジエチルアミノベンズアルデヒド（DEAB）の存在下および非存在下でALDEFLUOR試薬を用いたフローサイトメトリーにより測定した。フレームは、DEAB処理した細胞に基づいて作成し、未処理の細胞に適用されたALDH +細胞を描くゲートを表しています。 ALDH +細胞の割合がゲートに示されています。 （C）CD44 + CD24 +ゲートは、ALDEFLUORで染色した細胞、およびIgG2bκ- APC（CD44 – APC用アイソタイプコントロール）およびIgG2aκ- PE（CD24 – PEのアイソタイプコントロール）抗体に基づいて作成されました。 CD44 + CD24 +細胞の割合は、ゲートに示されています。