الاستقراء والتقييم من فئة التوحد التبديل في تنقية خلايا الفئران B
Summary
عقب التعرض لمستضد ، مجموعات سكانية فرعية من الخلايا باء يمكنهم الخضوع لعملية إعادة التركيب المعروفة باسم الطبقة التبديل (CSR) لإنتاج الأجسام المضادة مع وظائف isotypes المستجيب متميزة. بروتوكول المبينة في هذا التقرير يشرح كيف يمكن أن يتسبب المسؤولية الاجتماعية للشركات وتحليلها<em> في المختبر</em> لأغراض الدراسة وظيفة الخلايا باء.
Abstract
الحصانة الخلطية هي فرع من فروع الجهاز المناعي التي تحتفظ بها الخلايا البائية وتوسطت من خلال إفراز الأجسام المضادة. عند تنشيط خلايا B ، بموضع المناعي يخضع لسلسلة من التعديلات الوراثية لتغيير القدرة ملزمة وظيفة المستجيب يفرز الأجسام المضادة. ومن ابرز هذه العملية من خلال إعادة التركيب الجيني حدث المعروفة باسم التهجين تبديل فئة (CSR) التي يتم فيها استبدال الضد الغلوبولين المناعي isotype الافتراضي لأحد IgG و IgA ، أو إيج. كل isotype تمتلك وظائف متميزة المستجيب مما يجعل المسؤولية الاجتماعية للشركات حاسما في الحفاظ على الحصانة.
وتوسطت تنويع موضع المناعي من سيتيدين انزيم نازعة أمين التنشيط التي يسببها (AID). شريط فيديو التخطيطي اصفا هذه العملية بالتفصيل على شبكة الإنترنت (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). عادة يتم دراسة النشاط المعونة ومسار المسؤولية الاجتماعية للشركات في تقييم وظيفة الخلايا باء والحصانة الخلطية في الفئران. بروتوكول المبينة في هذا التقرير وسيلة لعزل الخلايا B من الطحال الفئران والتحفيز لاحقة مع lipopolysaccharide البكتيرية (LPS) للحث على التحول إلى فئة IgG3 (على الضد isotypes الأخرى أنظر الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام صبغة الفلورسنت تلوين الخلية Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) لمراقبة تقسيم خلية من خلايا حفز ، وهي عملية حاسمة لisotype التبديل 1 و 2.
تنظيم المساعدات والآلية التي يحدث المسؤولية الاجتماعية للشركات لا تزال غير واضحة ، وبالتالي في فحوصات المختبر تبديل فئة توفر طريقة موثوق بها لاختبار هذه العمليات في نماذج الماوس المختلفة. كانت هذه المقايسات التي سبق استخدامها في سياق نقص الجينات باستخدام الفئران بالضربة القاضية 3. وعلاوة على ذلك ، يمكن التبديل في المختبر من خلايا B يسبقه تنبيغ الفيروسية لتعديل التعبير الجيني بواسطة الحمض النووي الريبي ضربة قاضية أو التحوير التعبير 4-6. أثرت البيانات من هذه الأنواع من التجارب فهمنا للنشاط AID ، القرار من ردود الفعل المسؤولية الاجتماعية للشركات ، والأجسام المضادة التي تتوسط فيها الحصانة في الماوس.
Protocol
Discussion
بروتوكول المبينة أعلاه يوفر الفحص القياسية لتحليل التعبير AID وظيفة خلال تبديل طبقة من الخلايا الأولية باء الفئران. هذا البروتوكول يستخدم LPS البكتيرية للحث على التحول من الغلوبولين المناعي لIgG3 ، على الرغم من أن تتمكن من إجراء تعديلات على وسائل الإعلام للحث على تحفيز ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون إلى المختبر لإجراء مناقشات مفيدة مارتن. ويدعم هذا المنشور من خلال منحة من المعهد الكندي للبحوث الصحية (MOP – 89783). معتمد بواسطة كرسي أبحاث كندا جائزة الفئة الثانية.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
Riferimenti
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
