בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

I. הכנה של תאים סרטניים השחלות לגדול סרטן השחלות שורות תאים להביע בלוציפראז בתרבות. מקורות בלוציפראז ניתן Firefly, Renilla, או מינים אחרים. תאים להביע את חלבוני ניאון יכול לשמש גם. להדגמה זו אנו משתמשים בסרטן השחלות התא קו, OVCAR5, להביע גחלילית בלוציפראז. קציר תאים באמצעות טכניקה שגרתית תרבית תאים. שמור את ההשעיה תא (10,000 תאים / μL) ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) על הקרח עד זמן ההזרקה. השנייה. Intrabursal Injection הליך זה מחייב סיוע מאדם נוסף. כל הנהלים כירורגית מתבצעת בתנאים aseptic. זה כולל לבוש בלבוש כירורגית באמצעות מכשירי ניתוח סטרילי, מזרק, ומחטים. הכן את ההרדמה על ידי ערבוב 3 מ"ל של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג / מ"ל), 1.6 מ"ל של hydrochloride xylazine (100 מ"ג / מ"ל), 1.5 מ"ל של acepromazine (10 מ"ג / מ"ל), ו 20 מ"ל של נתרן כלוריד 0.9%. בדוק את מספר הזיהוי של בעלי חיים בריאות הנצפה. להרדים את החיה עם ההרדמה קטאמין-xylazine-acepromazine מוכן באמצעות הזרקה (IP) intraperitoneal עם נפח מנה של 8 ~ 9 מ"ל / ק"ג משקל גוף (BW). ודא החיה תחת רגיל מקובלת של הרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עם מלקחיים או אצבעות רגליו האחוריות של החיה. אם יש דוושת רפלקס, לחכות מישור עמוק יותר של הרדמה עד החיה אינו מגיב על הליך זה. הנח את צד הגב חיה על כרית גזה סטרילי עם הראש שלה מול משם בזנב מול כלפיך. נקודת החתך ממוקם שמאלה או ימינה של קו האמצע ומעל השחלות. גילוח או להרטיב את הפרווה עם אלכוהול 70% בנקודת החתך. הרם את העור הרטובות בעזרת מלקחיים לעשות חתך קטן עם מספריים במיקום dorsomedial ישירות מעל למקלדת השחלות שומן. כרית שומן השחלות צריך להיות גלוי מתחת לפני השטח של קיר הבטן. כרית השומן לזיהוי בקלות על ידי צבע לבן שלה לעומת רקמת ורוד כהה המקיפים אותו. הרם בעדינות את בטנה קיר הבטן ולעשות חתך קטן כמתואר לעיל (5). הניחו כרית ספוג גזה סטרילי מלוחים על קו האמצע הסמוך החתך. אתר את כרית השחלות שומן בעדינות למשוך אותו החוצה והשאר זה על גבי גזה. לייצב את השחלה על ידי כיווץ כרית שומן עם קליפ בולדוג. על פי עמדה לנתח מיקרוסקופ, השחלה כדי לאפשר החדרת המחט (30 מד, ז) לתוך לכופף את אבובית oviduct המובילים בבורסה. כאשר המחט מוחדרת לתוך המיקום הנכון, זה צריך להיות גלוי תחת בורסה. דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק להזריק 5 μL ההשעיה תא בין בורסה לבין השחלה בעוד מזרק ממוקם באתר ההזרקה. צעד זה דורש שני אנשים. אדם אחד דוחף את הבוכנה, בעוד אדם אחר טוען המיקום של המחט. הסר את המחט במהירות לאטום את האתר לנקב בעדינות אבל מספיק כדי לא לקרוע את אמתח ו אבובית. בורסה צריכה להיראות קצת נפוחה עם זריקה נכונה. שחרר את כרית השומן קליפ בולדוג בעדינות להחליף את מערכת הרבייה ובחזרה כרית השומן לתוך חלל הצפק. בעדינות לסגור את הקיר על ידי משיכת הגוף רירית הבטן העליונה מעל בטנה התחתונה. סגור את העור עם סיכות כירורגי או קליפים הפצע. מניחים את החיה מחלים לכלוב שלה לספק מקור חום בטוח כדי למנוע היפותרמיה להאיץ התאוששות. נטר את קצב הנשימה וקלות, החזרת טונוס שרירים, ואת היכולת לנוע מרצונם החופשי. כל אלה הם סימנים של התקדמות טובה לקראת התאוששות. סטייפלס או קליפים הפצע ניתן להסיר 7 ימים או יותר לאחר ניתוח. ג. מינהל Gavage אוראלי השתמש 18 ~ 20 מחט G gavage או צינורית האכלה עם קצה מעוגל. מחט gavage צריך להיות לא יותר מאשר המרחק מקצה ראשו של בעל החיים הצלע האחרונה. בדוק את מספר הזיהוי של בעלי החיים ובריאות הנצפה. בעדינות עורף החיה ידי אחיזה בעור על הכתפיים עם האגודל והאצבעות. איפוק אמור להיות תקיף מספיק עבור גפיים קדמי להיות מורחב לכל צד ו מהדרך. חיה לא אמור להיות מסוגל לתפוס את המחט. משוך בעדינות את הראש לאחור של החיה עם האצבע המורה, ויוצרים קו ישר דרך הצוואר והוושט. תמיכה לאחור של החיה עם החלק הפנימי של האגודל. בעדינות ובלי כוח, הכנס את המחט gavage משני צדי הפה על הלשון. בתנועה חלקה אחת, המחט צריכה לעבור כנגד גג הפה לאורך הוושט. Gravity צריכים להנחות את המחט בלי התנגדות לפגישה. אם יש כל resistance, להוציא את המחט ולהתחיל מחדש. איסור פרסום של בעלי חיים רפלקס לבלוע עשוי להיות מופעלות במהלך הכניסה. עם זאת, לא אמורה להיות שום התנגדות או מתנשף מן החיה. חשוב לוודא כי בעל החיים הוא נושם כאשר המחט נמצאת במקום על ידי בדיקת תנועת הנחיריים והחזה. לאט לאט לדחוף את הבוכנה של המזרק לוותר נפח המנה. הוצא בעדינות את המחט gavage בזווית מסלול אותו כדרך זה הוכנס במורד הוושט. מחזירים את החיה לכלוב שלה נשימה לפקח על התנהגות 5 ~ 10 דקות. IV. Imaging in vivo אנו משתמשים Caliper מדעי החיים לפקח על התנהגותם של תאים שהוחדר לתוך חלל intrabursal. ניסויים באמצעות מערכת זו בדרך כלל יש פרק זמן של 4 ~ 16 שבועות ממועד ההשתלה הגידול. הכן את הפתרון של D-luciferin (המצע של גחלילית בלוציפראז) על ידי המסת 5 ~ 20 מ"ג 1 מ"ל PBS וסינון דרך הממברנה 0.22 מיקרומטר עיקור. טעינת קאמרית אינדוקציה ידי הפעלת חמצן והן גז isoflurane. הפוך על זרימת הגז לתא אינדוקציה בלבד. קצב זרימת isoflurane נשמר ברמה נמוכה עד חיות מוכנים הדמיה. בדוק את מספר הזיהוי של בעלי החיים ובריאות הנצפה. מניחים את החיה בחדר אינדוקציה מואשם גז isoflurane. הסר את החיה מן החדר כאשר החיה נראית רדומה. ספק 200 μL של פתרון luciferin מוכן באמצעות הזרקה IP באמצעות מחט 30 G. חשוב לרשום את זמן ההזרקה על מנת לשמור על עקביות בין זמן ההזרקה luciferin וביצועים הדמיה לאורך כל תקופת המחקר. הנח את גב luciferin-מוזרק חיה לתוך תא אינדוקציה. הגדר את מערכת הדמיה את ההגדרות המתאימות. הקפד לאתחל את המערכת לפני הרכישה את התמונה החיה הראשונה. לכבות את זרימת הגז לתא אינדוקציה ולהדליק את זרימת הגז לתא הדמיה. מניחים את הגב חיה בהרדמה או בצד הגחון למעלה. הקפידו למקם את האף של החיות בצורת חרוט האף כדי לשמור על אינדוקציה הרדמה תקין. ודא החיה בתוך "נקודת עניין של רשת" כפי שצוין על ידי אור ירוק. סגור את הדלת של החדר ולרכוש את התמונה בזמן המתאים. הזמן יכול להיקבע על ידי קינטיקה. הסר את החיה מבית הבליעה הדמיה ולמקם אותו חזרה לכלוב שלה. צג התאוששות של החיות כפי שתואר "הזרקת Intrabursal". V. תוצאות נציג איור 1. הדמיה Vivo של תאים סרטניים בשחלות במודל עכבר orthotopic. OVCAR5 תאים להביע בלוציפראז הוזרקו intrabursally לתוך השחלה ימין צילמו לאורך זמן. תמונות צולמו 13 (משמאל), 17 (באמצע), ו 22 (ימין) ימים לאחר ההזרקה באמצעות מערכת הדמיה IVIS ספקטרום. בצד הגב מוצג בלוח העליון בצד הגחוני הוא בפאנל התחתון. שים לב כי התפשטות של תאים סרטניים הצפק 22 ימים לאחר ההזרקה. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים Fox Chase Cancer Center של ועדת שימוש.