Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

1. Visão geral do ESR Micro-imagem Primeiro, nós fornecemos uma breve explicação do ESR, microscopia ESR, e os vários componentes do nosso sistema, e em seguida iremos descrever as experiências de imagem real. Ressonância paramagnética eletrônica é uma técnica espectroscópica em que a radiação eletromagnética em uma freqüência específica é absorvida pelas moléculas com spins elétron desemparelhado, colocada sob um campo magnético externo estático (Figura 1). ESR é empregada em grandes áreas da ciência, como química, biologia, física e ciência dos materiais, para a detecção e identificação de radicais livres e centros paramagnéticos. É um poderoso método para estudar o ambiente de moléculas paramagnéticas em espécies vivas e fornece informações sobre a acidez (pH), viscosidade, oxigênio e espécies reativas de oxigênio concentrações 3. Para amostras heterogêneas, ESR informação espectral pode ser obtido de uma forma espacialmente resolvidos (ie, através da obtenção de uma imagem), através do uso de gradientes de campo magnético 4. Isto é muito semelhante ao método mais comum de ressonância magnética (MRI), que gira principalmente observa próton. Até agora, as técnicas de imagem, ESR foram aplicados para espécimes vivos com tamanho relativamente grande de alguns centímetros e milímetros escala resolução. (Por exemplo, veja a Figura 2, retirados de referência 5.) Desenvolvimento relativamente recente no ESR imagem é a extensão de sua capacidade de olhar para pequenos animais em milímetros escala resolução para as medições de amostras milímetros e sub-milímetro de tamanho com escala mícron resolução. Este campo é conhecida como microscopia de ESR, que hoje pode fornecer imagens 3D ESR com uma resolução de 1 mícron aproximando 2 (ver exemplos representativos na Figura 3). ESR de um microscópio é essencialmente similar a um espectrômetro de ESR convencionais. Ele tem um ímã para a geração do campo estático, um sistema de microondas para a excitação de spin e detecção do sinal, uma sonda para a realização da amostra, e um console informatizado para controlar o processo de aquisição e manipulação de dados. Outros componentes de imagem a única ESR em geral e existentes também em microscopia ESR são fontes de campo magnético de gradiente, que são parte do sistema eletrônico, e bobinas de gradiente que estão localizados na sonda de imagem. Mais detalhes sobre o nosso sistema específico são mostrados no filme de protocolo e descrito na referência 2. 2. ESR Preparação da Amostra Micro-imagem Esta etapa descreve o método para preparação de amostras para o experimento ESR micro-imagem. No final desta fase as células são colocadas no fundo de um recipiente de vidro ESR especialmente preparado amostra microscopia juntamente com uma solução tampão por tritila radical 6. Este protocolo descreve a medição de células de cianobactérias e, portanto, para outros tipos de células, ajustes adequados podem ser necessários na fase de preparação da amostra. Primeiro, alguns quadrados de papel absorvente com um tamanho de 400 ~ 400 m são tomadas e inserido em um tubo Eppendorf, que é posteriormente preenchida com 1,2 mL da suspensão cianobactérias (a uma concentração de 40 mg / mL). A suspensão é centrifugada por 2 minutos a 6000 RPM em microcentrífuga. Depois disso, o buffer sobrenadante é completamente removido, exceto para ~ 50 mL que são deixados para evitar a desidratação cianobactérias. Como resultado deste processo, o papel absorvente agora saturados pelas células de cianobactérias. Usando uma pinça fina, algumas fibras são extraídas do papel e colocados no fundo de um suporte de copo-como amostra preparada especialmente de vidro 7. Seguinte ao de 3 mm de tritila em BG-11 solução de 8, 9 (ver Esquema 1) é adicionado ao porta-amostras com a ajuda de uma seringa bem. O titular é então selada com cola curável UV, deixando uma pequena saída de ar aberto. Stock 4 Stock 3 Stock 2 Stock 1 H 3 BO 3 2.86g/liter K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter Na 2 EDTA Mg 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter 0.6g/liter citrato férrico de amônio ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter Ácido cítrico: 1H2O 0.6g/liter </td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter Esquema 1. Preparação de BG-11 médio. 3. ESR Micro-imagem Experimentos Para começar o experimento de imagem, ligar o sistema ESR micro-imagem e inserir a amostra no ressonador que vai dentro da sonda de imagem. Agora, usando o software de controle de computador, defina o sistema em "Tune" e encontrar o modo de freqüência de microondas de ressonância da sonda, que será usado para as medições ESR. Em seguida, defina o campo magnético estático sobre o valor que corresponda à freqüência de microondas aplicada, definir os parâmetros de tempo para a seqüência de pulso e observar o sinal de ESR para se certificar de que o sistema funcione bem e que a amostra é bem preparado. Em seguida, defina os parâmetros de imagem, tais como o número de pixels, a força do gradiente, bem como a duração dos pulsos de gradiente para seus valores necessários. Após a instalação, coletar três imagens 3D ESR por uma imagem echo Hahn seqüência de pulsos (Figura 4) com interpulso separação, valores de  500, 600 e 700 ns. Luz projetada na amostra é ligado ou desligado, dependendo das condições necessárias experimental. Durante a aquisição, os dados são salvos automaticamente. Teses arquivos de dados brutos são então processadas via Matlab script de software para fornecer imagens da concentração por tritila radical eo tempo de relaxamento T mapa 2, que é traduzido em uma imagem concentração de oxigênio através de pré-existentes de calibração. 4. Resultados representante Os resultados do experimento são várias tridimensional ESR micro-imagens gravadas em diferentes valores de τ. Típico imagens brutas dados são fornecidos na Figura 5. As três principais imagens, medido em condições escuro, são muito semelhantes, exceto para a redução da intensidade do sinal. Por outro lado, a imagem muda padrão sob irradiação de luz devido aos tempos de relaxação diferentes em diferentes partes da amostra. Estes dados podem ser processados ​​1 para obter uma imagem amplitude, como mostrado na Figura 6 e também imagens do tempo de relaxação, T 2 (Figura 7). A T 2 imagens são traduzidas em valores de concentração de oxigênio através de uma curva de calibração pré-existente que liga a concentração de oxigênio para o tempo de relaxamento através da equação: Aqui, T 2 0 é o tempo de relaxação spin-spin da sonda sob condições anóxicas (dependendo da concentração da sonda, C, e seu coeficiente de difusão, D), e k é uma constante de proporcionalidade. Na maioria dos casos, o coeficiente de difusão não varia muito para amostras ao vivo (embora, se necessário, ele pode, em princípio, ser diretamente avaliada também por ESR 6, 10), ea concentração de spin é obtida durante o processo de imagem. Portanto, essa relação pode ser utilizada para medir diretamente a concentração de oxigênio. Voltando à Figura 6, é evidente a partir da imagem amplitude que as células de cianobactérias foram localizados principalmente no lado direito do titular da amostra. Além disso, com base na Figura 7, é claro que a luz inicia a produção de O 2 e provoca um aumento significativo da concentração da solução 2 O, principalmente nos voxels perto do cianobactérias. Figura 1: Níveis de energia em elétrons de ressonância spin. Figura 2: imagem de concentração típica de oxigênio de um rato do rolamento do tumor. A imagem da esquerda mostra as informações anatômicas, com base em uma imagem de ressonância magnética. Um estável livre radical orgânico foi injetado para o mouse e as suas características ESR fornecer a concentração de oxigênio em seu ambiente (direita). ESR baseado em resultados são sobrepostos a imagens anatômicas de ressonância magnética. Campo de visão é de 32 mm. Figura 3: Dois exemplos de alta resolução ES micro-escalaR imagens de amostra photolithographically gerados com N @ C 60 em pó (à esquerda) e cristais paramagnéticos LiPc (à direita) Figura 4: Típica Hahn imagem seqüência de pulsos mostrando o microondas (MW) e gradiente, G x, y G e G z pulsos. Figura 5: Típica-prima de dados ESR micro-imagens: a, b e c são dados brutos da amostra cianobactéria sem iluminação de luz medido para τ = 500600700 ns, respectivamente. Itens d, e, e são os mesmos que a, b e c, mas com iluminação de luz. Intensidade é plotado em escala arbitrária (mas é consistente dentro de cada conjunto de três imagens escuras ou claras de dados brutos) Figura 6: imagem de amplitude correspondente à concentração de radicais na solução (escala arbitrária). Figura 7: T 2 imagens e os correspondentes [O 2] valores no escuro (à esquerda) e leve (à direita) condições.