Detta protokoll innebär en icke-radioaktiva<em> In-situ</em> Hybridisering förfarande som gör det möjligt att samtidigt identifiera två avskrift arter, i en enda cell upplösning, i tunna delar av ryggradsdjur hjärnan.
Här beskriver vi en modifierad version av en dubbel fluorescens<em> På plats</em> Hybridisering (dFISH)-metoden optimerad för att upptäcka två mRNA av intresse i färskt frysta hjärnan sektioner. Vår grupp har framgångsrikt använt denna metod för att studera gener samreglering. Mer specifikt har vi använt denna dFISH metod för att utforska den anatomiska organisationen, neurokemiska egenskaper, och effekterna av sinnesupplevelse i centrala sensoriska kretsar på en enda cell upplösning. Detta protokoll har validerats i hjärnvävnad från möss, råttor och sångfåglar, men förväntas vara lätt att anpassa till andra ryggradsdjur, liksom till en rad icke-neurala vävnader. I den här filmen ger vi en detaljerad demonstration av de viktigaste stegen i detta förfarande.
Vi har använt detta protokoll för att studera hur ryggradsdjur hjärnan neurochemically och funktionellt organiserad, och att avgöra hur beteendemässigt relevant för sensoriska stimuli påverkar arvsmassans maskineri av nervceller i den vuxna hjärnan 8-10. Vi har framgångsrikt använt denna metod i hjärnvävnad från möss, råttor och sångfåglar, men räknar med att detta protokoll kommer att vara lätt att anpassa till hjärnan delar från en mängd ryggradsdjur och, kanske, icke-neuronala vävnad…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöds av bidrag från NIH / NIDCD och Schmitt stiftelsen till RP.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
RNasin | Promega | N2111 | ||
BSA | Sigma | 05491 | ||
DTT | Sigma | D5545 | ||
Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
EDTA | VWR | 101384-758 | ||
SDS | Sigma | L4390 | ||
Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
SSPE | VWR | 82021-488 | ||
Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
Vectashield | Vector | H-1000 | ||
embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
cryostat | Leica | CM 1850 | ||
Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
Solutions