HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

このメソッドは、で報告された研究で使用されてブナーらScience 323：。1743年から1747年（2009） 。 1。概要 HIVの細胞間のスプレッドは、もともとドナー細胞と一次CD4 +受容体の細胞は1,2,3のようなTリンパ球としてHIV感染Jurkat細胞を用いて記述されていた。これらの研究では、ウイルスは抗体染色を用いて固定された細胞で検出された。生細胞での細胞から細胞へのウイルスの伝達を追跡するために、我々は、HIVのGag – iGFP 4と呼ばれるHIVの遺伝子組換え、感染性分子クローンを利用する。それは、MAとCAのドメイン間のGagタンパク質に内部的に挿入された緑色蛍光タンパク質（GFP）を運びます。 HIVのこの分子クローンは、ヘルパーウイルスを必要とせずに感染性を保持します。このクローンから作られたウイルス粒子は、化学量論的に細胞間のウイルスのアセンブリとの転送を監視するために強い蛍光シグナルを提供し、緑色蛍光タンパク質がロードされます。不活性細胞トラッキング蛍光色素と組み合わせて使用すると、受容細胞は、入力のドナー細胞と区別し、一感染したT細胞から非感染T細胞5〜HIVの伝達を視覚的に確認できますすることができます。それらは密閉、ガス透過性の撮像室内で培養され、一方のセルから別のウイルスのウイルス学的シナプス形成と伝達は、生きた細胞で観察することができます。 （1日目） 2。 HIVギャグiGFPトランスフェJurkat T細胞の調製 Jurkat細胞培養培地中の× 10 5細胞/ mLのは、（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清、慎重に2 × 10 5と8の間の濃度で細胞を維持することにより、ヒトCD4 + T細胞株Jurkat（ATCC、マナッサス、VA）を準備100単位/ mLペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン）。成功への鍵：8 × 10 5細胞/ mLを超える濃度でJurkat細胞の培養は、トランスフェクション効率の低下になります。 注：以下に示すようにT細胞へのHIVギャグiGFPプロウイルスDNAのトランスフェクション、、複製コンピテントヒト免疫不全ウイルスの生産の結果。このように、すべての手続きは、認定されたバイオセイフティレベル2 +または生物学的安全性レベル3（BL2 + / BL3）組織培養室では、訓練を受けた検査技師が行うこととなります。イメージング施設における感染性HIVとの作業は、最寄りの機関のバイオセーフティの事務所によって承認されなければならない。 Amaxaのnucleofection法（ロンザ、ウォーカー、MD）を用いてウイルスプラスミド、HIVギャグiGFPとJurkatsをトランスフェクション。 150 × gで10分間の遠心分離によってペレット5 × 10 6細胞上清を吸引除去し、緩衝生理食塩水（PBS）滅菌リン酸で細胞を洗う。細胞を遠心分離し、メーカーのサプリメントを含むV予め温めておいた、nucleofectorソリューションの97μLにペレットを再懸濁します。細胞懸濁液にエンドトキシンフリーHIVギャグiGFPプラスミド（1μg/μLの）の三μLを加え、穏やかに混ぜる。プログラムS – 18を使用してキュベットとnucleofectに細胞懸濁液を移す。すぐに抗生物質なしで温めたジャー培養培地3 mlに細胞を移す。 ウイルス学的シナプスのためにCD4 +標的細胞を調製するために、我々は標準をFicoll – Paque（GE Healthcare社、ウプサラ、スウェーデン）プロトコルを使用して軟膜からヒト末梢血単核細胞を得る。 CD4 + T細胞は、マイナスの磁気ビーズ分離用キット（Miltenyi Biotec社、オーバーン、カリフォルニア州）を使用して選択されます。これらは、極低温冷凍メディアの5 × 10 6 cells/500μL（90％ウシ胎児serum/10％DMSO）のアリコートにおける液体窒素で保存することができる。解凍した主CD4 + T細胞はIL – 2の10単位/ mLで添加したRPMI、10％FBSで培養される。 （2日目） 3。 HIVギャグiGFPと蛍光色素で標的細胞の染色でトランスフェクションJurkatsから生細胞の回収 Jurkat細胞は、一晩トランスフェクションから回復することができます。その後、フィコールHypaque密度勾配の材料を介して遠心分離により細胞破片を除去。 15 mLコニカルチューブの底までをFicoll – Paqueの1.5 mLを分注する。優しくRPMI 5 mLの量で、トランスフェクションJurkatsでこの傾斜材料を重ねます。ブレーキをオフにし、室温で20分間400 xgで細胞を遠心分離します。慎重にピペットを使用してメディア/フィコールインターフェイスからセルを削除する。新しい15 mLコニカルチューブに移す。 10分間、300 xgで15 mLの遠心分離との合計量にRMPIで細胞を希釈する。ウェル2 cmのジャー培養培地3mLの（6ウェルプレート）でペレットを再懸濁し、組織培養インキュベーターにセルを返します。 細胞間の伝達実験でドナー細胞から標的細胞を区別するために我々は、蛍光色素でCD4 +標的細胞をprelabel。主なCD4 + T細胞であってもラベルが付いています使用前に優先します。我々は、CellTrackerとCellTrace染料（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）の両方でT細胞を標識する優秀な成功を収めている。色素濃度とインキュベーション時間が使用される特定の色素と細胞の種類に応じて最適化する必要がありますが、代表的なプロトコルは以下の通り。ペレット4 × 10 6主なCD4 + T細胞を10分間、400 × gで回転させて。 PBS 2ml中のPBSに懸濁する5 mLで細胞を洗浄。 1.5μMの最終濃度にCellTrackerオレンジを（CMTMR、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を加え、37℃で20分間℃でインキュベートする。完全なジャーメディアの8 mLを加え、10分間、400 × gで遠心。 IL – 2および組織培養一晩培養器内の場所の10単位/ mLを補充した完全培地3mLに細胞を再懸濁します。 （3日目） 4。生細胞イメージングを用いてHIVの監視の細胞間の転送ギャグiGFP 我々は日常的に48時間トランスフェクション後のHIVギャグiGFPトランスフェクトしたJurkat細胞を使用してください。しかし、我々は成功し、24時間には早くもセルを使用している、と72時間トランスフェクション後のように遅い。 約48時間トランスフェクション後、HIVギャグiGFP Jurkatsを発現する（CO 2の独立したメディア、10％ウシ胎児血清、、数えCO 2 -独立系メディア（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）で洗浄し、生細胞イメージングメディアに再懸濁している1〜3 × 10 7細胞/ mLの濃度で100 U / mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン、10単位/ mLのIL – 2）。 同様の方法で、洗浄および生細胞イメージングメディアの1-3 × 10 7細胞/ mLの濃度で主要なCD4 + T細胞を標識し懸濁します。 主なCD4 +扱わ組織培養に1:2または1時03分比と負荷時のT細胞は、ガス透過性、マイクロチャンバー（Ibidi、ベローナ、ウィスコンシン州）との混合感染は、Gag – iGFPトランスフェJurkats。例えば、標識一次CD4 + T細胞の40μLでHIVギャグiGFPトランスフェJurkatsの20μLを混合する。 Ibidi室にこの混合物50μLをロードし、プラグが付いているチャンバーをシール。パラフィルムでプラグ/ Ibidi室のインタフェースをラップしてプラグを固定します。 5。顕微鏡プラットフォームに関する考慮事項：回転するディスク共焦点イメージング細胞とIbidiイメージングチャンバーをロードした後、我々はすぐに倒立型光学顕微鏡（iX71オリンパス、センターバレー、ペンシルバニア州）の上にデバイスをマウントします。 Ibidi室は、適切な安全衣服を着てBL2 +訓練された実験室の担当者が顕微鏡に転送する必要があります。生きた細胞のイメージングは​​、一般的に安定した37℃の環境を維持するために高価なインキュベーションチャンバーを使用していますが、これはT型熱電対の先端と一緒に簡単で経済的な恒温器を（ASI 400、Nevtek、ウィリムズヴィル、バージニア州）を用いて達成されたの隣に取り付けられて適切な温度フィードバックのためのサンプル。我々はCO 2 -独立系メディアを使用して発見したCO 2チャンバーの使用を回避しながら、私たちは、高い細胞生存率を維持することができます。部屋の温度の変動に対してプラットフォームをバッファリングすると、背景の部屋の光を遮断するために、大きな黒のシュラウドは、システム周りの断熱エアポケットを作成する全体顕微鏡/ヒーターの設定を介して掛けている。これにより、温度変化とそれに関連する温度に関連するサンプルのドリフトを減少しますが、前にサンプルをマウントするまで30分間予熱を必要とします。 6。データ収集、転送、画像処理画像は、高開口数（NA）非常に解像度を向上させると60倍1.42 NA油浸対物レンズ（UPlanApo N、オリンパス）を用いて撮影されています。 3D共焦点画像を作成するには、スキャンが同時に飛躍的にスキャン速度を向上させる> 800共焦点スポットを使用して、回転するディスク共焦点ユニット（CSU – 10、Yokagawa、日本）によって実行されます。お世辞、その速度をするために、CSU – 10は、光退色や光毒性の両方を削減する、高速、低光のイメージングを可能にする高感度電子乗じ電荷結合素子（EMCCD、IXON + 897、アンドールテクノロジーズ、アイルランド）カメラと対になっています。蛍光光源は、によって選択される所望の波長（488 nm）とレーザーのパワーは右の顕微鏡対物レンズ（<1 mW）の前に測定された多波長ArKrイオンガスレーザー（イノーバ70C、コヒーレント、サンタクララ）は、音響光学波長可変フィルタ（AOTF）、（アンドールテクノロジーズ）。新たに取得した画像をCCD（15-30ミリ秒露光）から配信されている間、さらに退色を軽減し、全体の撮像時間を延長するには、急速にAOTF（マイクロ秒）は、レーザービームからカメラが非アクティブになるたびに（10〜20ミリ秒）をシャットダウンしますコンピュータに。レーザー光は405/488/568/647クワッドバンドダイクロイックミラーを（Semrock、ロチェスター、NY）を使用して回転するディスクのシステムに結合されている。蛍光発光は、フィルターホイール（Ludl電子製品、ホーソーン、ニューヨーク州）の内部に50分の525バンドパスフィルタ（Semrock）を使用してフィルタリングされるマウントBEMCCDカメラと共焦点回転するディスクユニットをetween。 Zステージ（マッドシティ研究所、マディソン、WI）を​​含むすべてのハードウェアと買収は、、アンドールiQのV1.8ソフトウェアによって制御されます。 1.2から1.9秒程度の3D画像スタックでの買収の速度を最大化するために、我々は細胞ペアのすぐ近くにEMCCDのカメラの記録領域をトリミング。さらに、Zの一部の情報を犠牲にして、0.45から0.75μmの間に大きなz -ステップは、買収をスピードアップするために使用することができます。これらの条件下でのイメージングは​​6時間まで持続することができます – 連続20〜60分のセグメントを使用して – 最小限の退色と。画像の数万は取られると完全に、各データセグメントは通常、スペースの5〜20 Gbを占めている。大規模なデータファイルの転送や分析を容易にするために、それぞれ買収セットは、分解し、アンドールiQのV1.8ソフトウェアを使用して1GbのTIFFイメージファイルのセグメントとしてエクスポートする必要があります。ここから、多くの優秀なソフトウェアパッケージは、Metamorph、Volocityすると、ImageJなどの画像解析、（我々はその変化フィジーをお勧めします）をご用意しています。 つの蛍光マーカーが追跡されなければならない時に、我々は、同時に使用することで買収を落とすことなく、それらの両方を記録"分割画面モードを。"両方のマーカーを一度に二つの異なるArKrのレーザライン（多くの場合、488と568 nmの）によって励起される。 EMCCDカメラは、2つの異なるイメージが分離画像スプリッタ（OptoSplit II、ケアン、ケント、イギリス）になる前に直接挿入。各画像は、その後独立して一度、"分割画面"効果を作成することで、カメラで蛍光フィルター（Semrock）と予測される横並びを用いて濾過する。これは、手動トリミングし、後で画像処理で画像の位置合わせが必要になります。 7。画像処理とデータ解析のための考慮事項我々は、通常、Macintoshコンピュータ上でVolocity（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム）（アップル社）で画像解析を行う。回転するディスクのレーザー共焦点顕微鏡画像は、最初のVolocityでデコンボリューションし、退色を補正するために彼らの強さに調整されます。ギャグ涙点の強度の測定とトラッキングがVolocity定量化モジュールで実行されます。予め形成されたシナプスの相対運動を計算する必要が画像セットの場合、自動追跡アルゴリズムは、シーケンス全体を通してシナプスボタンを追跡するため採用されている。オートトラッキングソフトウェアで定義された関心領域の手動検査は、ソフトウェアが正しく、目的のオブジェクトを追跡していることを確認するために実行する必要があります。周囲の物体とのコントラストが弱すぎるのオブジェクトの場合は、手動での追跡は、フレームごとに実行することができる。 Volocityソフトウェアパッケージは、XYZの位置、ボリュームと目的のオブジェクト内で統合された信号の輸出が可能になります。追跡対象オブジェクトのシナプスと速度からの距離は、シナプスボタンの中心に動きを正規化することによって計算されます。 8。代表的な結果つを混合10〜15分以内に主要なCD4 + T細胞に接着したJurkat細胞を発現するHIVギャグiGFPを可視化することができるはずです。イメージングこれらの複合体、一synaspe後に感染した細胞でだけでなく、標的細胞のギャグの涙点の動きを評価することができます。一つは、シナプスが形成されている直後に標的細胞にギャグiGFP涙点の動きを観察することがあります。