Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

1. Lo sviluppo degli embrioni Quando sono previste, le uova sono raggruppati a causa di filamenti attaccamento al corion. Per consentire gli embrioni si sviluppano normalmente, è necessario separare le uova. Groviglio e tagliare filamenti attaccamento tenendo i filamenti allegato con due pinze. Dopo unclustering, le uova sono separati da feci e alghe e trasferita ad un mezzo embrione fresco ad una densità massima di 40 uova per ogni piatto 6 centimetri di Petri. Embrioni Medaka sviluppare leggermente più lento rispetto zebrafish a 27 ° C. I tempi di schiusa è diverso tra le due specie; embrioni Medaka portello dal corion in 7 giorni e cominciare subito a nuotare e mangiare, mentre gli embrioni di zebrafish schiudono in 2 giorni, ma iniziano a nuotare e mangiare in 5-6 giorni. Sviluppo di Medaka si svolge secondo 4 Iwamatsu messa in scena è. Lo sviluppo degli embrioni Medaka può essere comodamente regolato piani sperimentali, selezionare la temperatura appropriata. Sviluppo di embrioni Medaka può essere fermato a 4 ° C nel primo sviluppo. Dopo la tappa 24, quando il cuore inizia a battere, lo sviluppo può essere rallentato con una temperatura minima di 18 ° C. I tempi di comparsa di organi / tessuti è leggermente diverso in Medaka rispetto al pesce zebra, vale a dire in somitogenesis Medaka si verifica dopo l'inizio dello sviluppo del cervello mentre in somitegenesis zebrafish precede lo sviluppo del cervello. 2. Rimozione del corion Il corion di Medaka è costituito da due strati protettivi con uno strato duro interno e una superficie morbida esterna. Così, in due fasi di trattamento della proteasi impiegando pronasi ed enzimi cova è necessario rimuovere questo corion. Una volta dechorionated, gli embrioni devono essere conservati in 1X BSS. Semi-sterile condizioni miglioreranno la cultura di successo degli embrioni dechorionated, specialmente quando lunghi periodi di osservazione sono obbligatori. Queste includono l'utilizzo di soluzioni sterili (ad esempio sterilizzati 1X BSS con gli antibiotici) e gli strumenti sterilizzati con etanolo al 70% seguita da risciacquo con 1X BSS. Come dechorionated embrioni Medaka sono più morbide e più fragili di embrioni di zebrafish dechorionated, particolare attenzione deve essere presa per assicurare che non entrino in contatto con l'aria o bolle nella pipetta, in modo da causare il collasso immediato. Per garantire il minimo danno agli embrioni, una bocca larga pipetta di vetro lucido con pompa di calore pipetta deve essere utilizzato per il trasferimento di embrioni e un ciclo capelli dovrebbero essere utilizzate per orientare gli embrioni per l'osservazione. Non aderente scatole di Petri devono essere usati per prevenire gli embrioni di attaccarsi alle superfici. Prima di dechorionation è opportuno verificare che le uova sono state sufficientemente separati e ripulito. Dal momento che sia pronasi ed enzimi cova sono proteinasi, dovrebbero essere tenuti in ghiaccio e minimizzare l'esposizione degli embrioni a questi enzimi. Trasferimento uova di carta vetrata (grana P2000, impermeabile) posta nel coperchio di un piatto nove centimetri Petri. Rimuovere l'eccesso di media, ma garantire un volume sufficiente resta contro l'essiccamento della embrioni. Ruotare delicatamente embrioni per circa 45-60 secondi per rimuovere alcuni dei peli superficie esterna e punteggio leggermente la superficie del corion (Figura 1). Trasferimento degli embrioni indietro originale Petri ed esaminare. Quando gli embrioni che rotola su carta vetrata usare il dito indice, applicando una pressione minima e mantenendo le dita parallele alla superficie della carta vetrata. Non tiro più di 5-7 embrioni alla volta. Questa precauzione riduce al minimo il rischio di schiacciare gli embrioni sotto l'altro. Sostituire medio uovo in un piatto con pronasi 20mg/ml ed embrioni incubare per 40-60 minuti a 27 ° C. Assicurarsi che gli embrioni sono sufficientemente coperti da pronasi e un coperchio è presente sul piatto. Pronasi non utilizzati devono essere tenuti in ghiaccio durante questa fase di minimizzare auto-digestione e può essere riutilizzato fino a quando l'attività è persa (circa 1-2 settimane). Recuperare pronasi per il riutilizzo e lavare gli embrioni 5X in media embrione per rimuovere le tracce di pronasi quanto ciò inattivare l'enzima cova da aggiungere. Rimuovere medio embrione embrioni e coprire con l'enzima cova, assicurando embrioni riunirsi in monostrato nel piatto. Se le uova sedersi su uno sopra l'altro nel piatto, quelli in basso saranno schiacciati come il corion si dissolve. Tenere enzima utilizzato cova sul ghiaccio. Incubare gli embrioni a 27 ° C e dopo 15 minuti controllare periodicamente i progressi della cova utilizzando uno stereomicroscopio. Si vedrà che un certo numero di cratere lunare, come i buchi cominciano ad apparire nello strato interno del corion, che si dissolve ben presto seguendo questo lasciando lo strato morbido esterno del corion facilmente rimosso manually. L'intero processo di schiusa può richiedere 15-60 minuti. Non appena gli embrioni escono dal corion, il trasferimento degli embrioni a una piastra di Petri contenente 1X BSS. Assicurarsi di non trasferire enzima da cova verso la BSS 1X toccando la punta della pipetta sulla superficie del BSS permettendo al embrioni a rotolare delicatamente. Una volta che tutti gli embrioni vengono trasferiti da enzima cova, effettuare un trasferimento finale ad un altro piatto fresco di 1X BSS. In questo modo gli embrioni non siano esposti a eventuali residui di enzima cova, in quanto ciò potrebbe danneggiare gli embrioni esposti. Una volta in questo piatto finale di tutti gli embrioni che possiedono ancora lo strato esterno del corion possono essere liberati manualmente utilizzando sterilizzati micro-pinze con lo stereomicroscopio. Se gli embrioni devono essere sviluppate dechorionation seguenti, penicillina / streptomicina deve essere aggiunto il BSS per prevenire la crescita batterica. Figura 1. Confronto di embrioni arrotolato e srotolato durante dechorionation. Osservate come gli embrioni pannello arrotolato in B mancano i capelli visto sul embrioni srotolato nel pannello A. 3. Montaggio embrioni dechorionated Embedding agarosio è utile per lunghi periodi di immagini (ad esempio, time-lapse imaging) per gli embrioni di vivere così come per osservazioni dettagliate di embrioni fisso. Durante la gastrulazione e organogenesi precoce (stadio 14 a tappa 28), embrioni Medaka mostra ondate di movimenti ritmici contrattile attraverso il periderm, uno strato di tessuto che copre sia nello sviluppo embrionale e il tuorlo 5. Gli embrioni sono trattati con 3,5 mm 1-eptanolo per fermare i movimenti contrattili 6. Per fermare il movimento di embrioni dopo la tappa 28 (64hpf), gli embrioni vengono anestetizzati con l'aggiunta di gocce di Tricaine mesilato (TMS) prima di incorporamento. TMS è aggiunto anche l'agarosio (aggiungere solo una minima quantità, questa dose deve essere ottimizzato, circa una diluizione 1:25). Scongelare una piccola quantità del 3% agarosio a bassa temperatura di gelificazione (in 1X BSS), con il riscaldamento a 37 ° C e mantenendolo a tale temperatura. Le seguenti operazioni devono essere svolte rapidamente per garantire che l'agarosio non solidificare prima orientare l'embrione. Usando una bocca larga trasferimento pipetta di vetro fuso sufficiente agarosio a riempire la depressione tappo di una provetta Eppendorf. Trasferimento di un embrione dechorionated alla depressione tappo minimizzando riporto BSS con l'embrione. Immediatamente l'assorbimento e l'agarosio embrione dalla depressione cappuccio e trasferimento in una camera di cultura capsula di Petri. Un piatto di Petri 3,5 centimetri con una finestra di vetro sul fondo viene utilizzato. Per le immagini utilizzando un microscopio invertito, gli embrioni sono orientati a faccia in giù il corpo e posto vicino al vetro di copertura. Per le immagini utilizzando un microscopio in posizione verticale, lo spessore di agarosio è ridotto al minimo. Trasferire il piatto 3,5 centimetri Petri in un piatto di 14 centimetri di diametro Petri contenente acqua e ghiaccio (acqua riempito circa 1 / 3 profondità totale di piatto di grandi dimensioni). Mentre tenendo la camera con decisione sul fondo del piatto 14 centimetri Petri, utilizzare un ciclo capelli per orientare delicatamente l'embrione come desiderato nel fuso agarosio e tenere l'embrione fino alla agarosio solidifica delicatamente alzare ed abbassare il piatto più piccolo nella sua posizione originale in acqua gelida. 4. Trapianto di cellule negli embrioni Medaka L'obiettivo di questa procedura è quello di determinare se il gene di interesse atti cellule autonomamente (all'interno di una cella) o non cellulari autonomamente (tra le cellule). Cellule del donatore possono essere etichettati con un colorante tracciante come rodamina-destrano prima del trapianto (come descritto in 'microiniezione di embrioni Medaka' il protocollo che accompagna Giove) o di un ceppo transgenico con espressione GFP può essere utilizzata, che permetta di valutare il trapianto. Una combinazione di entrambe le tecniche di etichettatura è spesso utile a superare l'auto-fluorescenza che si possono incontrare. Per time-lapse studi dopo il trapianto, l'espressione della GFP è particolarmente utile. Utilizzare una pipetta ad imboccatura larga in vetro con pompa pipetta durante tutta la procedura e sterilizzare tutti gli strumenti (compresi gli scivoli) in anticipo con il 70% EtOH seguito da un risciacquo con sterili 1X BSS. Embrioni destinatari sono in genere sviluppati intorno al palco 12 come questo permette la discriminazione dei poli ventrale e dorsale nello svolgimento trapianto. Iniziare dechorionating embrioni 1,5 ore prima del trapianto e l'iniezione apparato di setup durante l'incubazione dell'enzima. Posizionare un vetrino da microscopio cavità in un piatto di 9 centimetri di diametro Petri. </li> Aggiungere una piccola quantità del 3% di metilcellulosa al centro della diapositiva cavità con una punta di pipetta sterile e diffondere sottilmente. Metilcellulosa asciugare per circa 1-2 minuti. Aggiungere 350μl di sterili 1X BSS a riempire la depressione diapositive. Trasferimento di un embrione donatore e fino a quattro embrioni destinatario alla diapositiva con una pipetta di vetro. Embrioni orientarsi utilizzando un ciclo capelli in modo che il Blastoderm dell'embrione è rivolto verso l'alto. Gli embrioni possono essere appoggiati uno contro l'altro per aumentare ulteriormente la stabilità. Inserire delicatamente la micro-ago nel Blastoderm donatore e lentamente assorbimento 10-20 cellule. Inserire delicatamente l'ago in area richiesta di Blastoderm destinatario embrione ed espellere le cellule lentamente. Grande attenzione dovrebbe essere presa quando si inserisce nelle cellule Blastoderm destinatario in modo da non disturbare la cellula-uovo confine sacco in quanto ciò può provocare la morte dell'embrione. Versare sterilizzati 1X BSS nella capsula di Petri. Versare cautamente il BSS in piatto più vicino al lato del piatto il più possibile in modo da non disturbare gli embrioni. Non versare mai il BSS direttamente sul embrioni e aggiungere sufficiente BSS in modo che la diapositiva e gli embrioni sono immersi. Aggiungere 100μl di penicillina / streptomicina per il piatto e coprire. Con attenzione trasferire il piatto ad un 27 ° C incubatore per consentire il normale sviluppo. Gli embrioni possono essere periodicamente osservare come desiderato. Quando si utilizza il trapianto di effettuare guadagno di funzione e / o esperimenti di salvataggio fenotipo, alcuni cambiamenti morfologici osservati potrebbe essere dovuta agli effetti del trapianto. Così trapianti multipli sono necessari. Dopo 2-3 giorni, melanofore deve essere presente sul sacco vitellino, testa, occhi e del tronco. Se presente sugli embrioni poi trapiantato con successo chimera è probabilmente stato prodotto (Figura 3). Se necessario, embrione donatore genotipo (s), trasferendo alla PCR tubo (s) contenente 20mg/ml 25μl di proteinasi K. Incubare a 55 ° C per 4 ore seguiti da 10 minuti a 94 ° C ed eseguire PCR. 5. Rappresentante risultati Figura 2. Posizione Esempio di agarosio-embedded embrione. Anteriore è mostrato a destra e la vista è dorsale. Pannello B: cellule endoteliali possono essere visti su entrambi i lati del corpo dell'embrione e sono etichettati con GFP guidata dal promotore fli. Figura 3. Immagini di post-trapianto di embrioni. Una immagine mostra un embrione donatore e ricevente immediatamente post-trapianto. L'embrione donatore viene mostrato sulla destra con un Blastoderm completamente rossa (freccia). L'embrione destinatario è mostrato sulla sinistra ed è facilmente identificabile dalla piccola massa di cellule trapiantate rosso visibile nella Blastoderm (punta di freccia). B immagine mostra due embrioni destinatario circa 7 ore dopo il trapianto (incubazione a 27 ° C). Notate le cellule trapiantate sono migrate dal sito del trapianto e sono ora dispersi in tutto il Blastoderm (frecce). Immagine C mostra un embrione destinatario a st.29 (circa 74hpf). Si noti la pigmentazione negli occhi e la presenza di melanofore nella regione del tronco e del cervello (frecce). La rodamina marcato le cellule possono essere visti da colonizzare molte delle strutture embrionali che indica la produzione di successo di una chimera.