Mesure de l'activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux
Summary
Cet article détaillera le protocole de mesure de l'activité calpaïne dans les cellules fixes et de vie en utilisant la cytométrie de flux.
Abstract
Les calpaïnes sont omniprésents intracellulaire, sensible au calcium, cystéine-protéases neutres<sup> 1</sup>. Les calpaïnes jouent un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques, y compris la signalisation, le remodelage du cytosquelette, la régulation de l'expression des gènes, l'apoptose et la progression du cycle cellulaire<sup> 1</sup>. Les calpaïnes ont été impliqués dans de nombreuses pathologies, y compris les dystrophies musculaires, cancer, diabète, maladie d'Alzheimer et la sclérose en plaques<sup> 1</sup>. Calpaïne la réglementation est complexe et incomplètement compris. les niveaux d'ARNm et de protéine faible corrélation avec l'activité, limitant l'utilisation de techniques d'expression de gènes ou de protéines pour mesurer l'activité des calpaïnes. Ce protocole décrit une vidéo cytométrie en flux développé dans notre laboratoire pour mesurer l'activité calpaïne dans les cellules fixes et vivant. Cette méthode utilise le substrat fluorescent BOC-LM-CMAC, qui est clivée spécifiquement par la calpaïne, pour mesurer l'activité des calpaïnes.<sup> 2</sup> Dans cette vidéo, l'activité calpaïne dans fixes et vivant des cellules de leucémie murine 32Dkit, seul ou comme partie d'une population de splénocytes est mesuré en utilisant une LSRII (BD Bioscience). Cellules sont 32Dkit montré une activité élevée par rapport aux splénocytes normaux.
Protocol
Discussion
L'activité calpaïne dans les cellules 32Dkit fixe et la vie a été déterminée dans ce protocole vidéo. Traitement de la lignée cellulaire avec l'inhibiteur de calpaïnes PD150606 entraîné une inhibition complète de l'activité calpaïne dans les cellules. En outre, le traitement avec l'inhibiteur de MEK1 PD98059 entraîné une inhibition complète de l'activité calpaïne dans les cellules. ERK est un important activateur de la calpaïne-2 3. Ces résultats suggèrent que l'a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutenu par des subventions des Instituts canadiens de recherche en santé, La Société de leucémie et lymphome du Canada et la Fondation Lymphome du Canada.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
Riferimenti
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
