نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية
Summary
نحن نقدم طريقة لاستنساخه monolayers زراعة الأجنة البشرية متموجة الخلايا الظهارية في شبكية العين صباغ (hfRPE) الذي يحمل مورفولوجيا الخلايا ، علم وظائف الأعضاء ، قطبية ، والبروتين وأنماط التعبير الجيني للأنسجة الأم الكبار. وقد تم تمديد هذا العمل إلى نموذج حيواني من عدة أمراض العيون.
Abstract
وضعنا الداخلي ثقافة الخلية التي يمكن أن تنتج كميات كبيرة من monolayers متموجة من الجنين البشري الأساسي الثقافات صباغ الشبكية (hfRPE) ظهارة مع الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية والجينية لRPE الإنسان الأصلية. هذه الثقافات الخلية hfRPE المعرض تصبغ الثقيلة ، والمجهر الإلكتروني تظهر واسعة الزغيبات الصغيرة الغشاء القمي. وقد تم تحديد المجمعات صلي وسم المناعي مع مختلف البروتينات مفرق ضيق. قطبية الظهارية وظيفة تلك الثقافات الأولية استنساخه بسهولة شبها درس سابقا نماذج من الثدييات RPE الأصلية ، بما في ذلك الإنسان. وتم تمديد هذه النتائج من خلال تطوير التدخلات العلاجية في النماذج الحيوانية العديد من أمراض العين البشرية. وقد ركزنا على استراتيجيات لإزالة تراكم السوائل غير طبيعي في الشبكية أو في الفضاء تحت الشبكية. الفضاء خارج الخلية تحت الشبكية يفصل قطاعات مبصرة الخارجي والغشاء القمي للRPE وهذا أمر مهم لصيانة التجهيزات والمعدات الشبكية ، ومجموعة كاملة من RPE / الشبكية التفاعلات.
Protocol
1. الجنين الأنسجة البشرية جميع البحوث المتعلقة الأنسجة البشرية يتبع المبادئ الواردة في إعلان هلسنكي وهيئة المعاهد القومية للصحة استعراض المؤسسية. ويتم الحصول على عيون الجنين قبل القواد المستقلة والموارد العلوم البيولوجية المتقدمة (ABR ، ألاميدا ، كاليفورنيا) ، من الجهات المانحة عشوائية في 16 إلى 22 أسبوعا من الحمل ، وضعت في وسائل الاعلام – 1640 RPMI تحتوي على أنابيب (التي قدمها ABR) ، ومعبأة على الجليد ، و ألقاه خدمة أولوية التسليم بين عشية وضحاها. الأنسجة تبقى قابلة للحياة ما يصل الى 48 ساعة بعد قلع. 2. خلية ثقافة متوسطة يستخدم MEM ألفا معدلة المتوسطة (سيغما الدريخ) باعتبارها وسيلة لإعداد قاعدة 5 ٪ و 15 ٪ تحتوي على وسائل الاعلام المصل لزراعة الخلايا RPE (RPE المتوسطة ، ويتضمن الجدول 1 أدناه). اسم سيغما Gibco مبلغ تخزين MEM ، تعديل ألفا M – 4526 500 مل +4 درجة مئوية تكملة N1 N – 6530 5 مل +4 درجة مئوية البنسلين الستربتوميسين 15140-148 5 مل -20 درجة مئوية GlutaMax — I 35050 5 مل -20 درجة مئوية غير الأحماض الأمينية الأساسية M – 7145 5 مل +4 درجة مئوية THT * -80 درجة مئوية توراين T – 0625 125 ملغ هيدروكورتيزون H – 0396 10 10 ميكروغرام Triiodo – thyronin T – 5516 0.0065 ميكروغرام مصل بقري جنيني ** 5 ٪ أو 15 ٪ -80 درجة مئوية الجدول 1. الإنسان متوسطة RPE الجنين مكونات لإعداد متوسطة 500 مل * يتم من خلال حل توراين THT – هيدروكورتيزون triiodo – 1 – thyronin في برنامج تلفزيوني 1.5 مل قبل اتخاذ المتوسط. مصنوعة aliquots متعددة وتخزينها على -80 درجة مئوية إلى تبسيط إعداد للزراعة متوسطة الثقافة. ** لم يتم الحصول على مصل بقري جنيني من سيغما الدريخ أو Gibco. يتم الحصول على مصل بقري جنيني المستخدمة في إعداد وسائل الاعلام من المستحضرات البيولوجية اتلانتا (نوركروس ، GA). كل زجاجة المصل هو المعطل الحرارة (56 درجة مئوية لمدة 1hr) قبل استخدامها. لضمان الاتساق الخلية كميات كبيرة من المصل ثقافة من الكثير نفسه يتم شراؤها وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى أنها تستخدم لإعداد وسائل الإعلام. تزرع الخلايا المصنف قليلة من دفعة محددة من الخلايا hfRPE في 24 — أو 12 — لوحات جيدة لبضعة أسابيع في وسائل الإعلام التي تحتوي على 20 ٪ من FBS الكثير مختلفة. الخلايا الأسرع نموا melanated مع التشكل RPE معظم الكلاسيكية (الحصوه) تشير إلى وجود الكثير المصل المناسب والتي يمكن استخدامها للثقافة الخلية. مستنبت الخلية يحتوي أيضا على : تكملة N1 (سيغما الدريخ) 1:100 مل / مل ، GlutaMax / البنسلين الستربتوميسين 1:100 مل / مل (Gibco) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية الحل (سيغما الدريخ) 1:100 مل / مل. بالإضافة إلى ذلك ، هيدروكورتيزون (20 ميكروغرام / لتر) ، توراين (250 ملغم / لتر) ، وtriiodo – thyronin (0.013 ميكروغرام / لتر) (تى اتش تى) مستعدة قدما عن طريق تذويب هذه المكونات الثلاثة في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 1:500 (مل / مل). يتم تخزين Aliquots THT من 80 درجة مئوية في حين إضافتها إلى RPE المتوسطة. 3. خلية ثقافة على الاستلام ، وتشطف الكرات سليمة في محلول مضاد حيوي مضاد فطري (مخفف ل10X ؛. القط لم 15240-096 ؛ Invitrogen) زائد الجنتاميسين (1 ملغ / مل) لمدة 3 الى 5 دقائق (الشكل 1 أدناه). الشكل 1. بعد أن يتم شطف قبالة حضانة المضادات الحيوية مرتين مع المتوسط مثل HBSS أو برنامج تلفزيوني. ينقل أحد العالم في الوقت عينه الى 10 سم مع طبق بتري المغلفة مع Sylgard – 184 (WPI) والمضمون مع 27G الإبر. باستخدام سكين sideport اضح المعالم (الكون) هو إجراء شق طريق صلبة تحت الجسم الهدبي (1 / 3 المسافة من خط الاستواء إلى سطح العين الأمامي). يتم استخدام هذا شق لبدء قطع دائرية لإزالة الجزء الأمامي للعين. يتم هذا الخفض باستخدام كربيد التنغستن المغلفة منحني مقص القزحية مع شفرة مسننة واحد (FST). قبل إزالة الجزء الأمامي من العين ، يتم إجراء خفض من خلال الجسم الزجاجي لتجنب فصل آرetina من RPE في القطب الخلفي. بعد إزالة الجزء الأمامي من العين ، وحضنت القطب الخلفي مع dispase – I الحل (يو 2 / مل ، والقط لا 04942086001 ؛. روش تشخيص ، انديانابوليس ، IN) في المتوسط 5 ٪ مصل يحتوي على 40-60 دقيقة في 37 ° C CO – 5 ٪ 2. بعد العلاج dispase ، يتم نقل أعمدة الخلفي لHBSS في أطباق بتري مع حشوة السيليكون (184 Sylgard ؛ داو كورنينغ ، ميدلاند ، MI) وتشريح في الأرباع أو أكبر قطعة لشد الأنسجة بما فيه الكفاية. ثم تتم إزالة بلطف الشبكية بالملقط. وكانت طبقات RPE مقشر وحيدة الخلية في ورقة الخروج وتحصيلها مباشرة في حل التربسين – EDTA (Gibco ، # 25200-056) الباردة. بعد أن يتم جمع RPE ، وأنابيب مغلقة مع الأنسجة في التربسين – EDTA وتحويلها إلى مياه الاستحمام لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد 10 دقيقة من الحضانة ، واهتزت بقوة أنابيب لفصل RPE في مجموعات صغيرة. إذا كان الانفصال ليست كاملة ، يتم وضع أنابيب المياه مرة أخرى إلى الحمام لمدة 5 دقائق. بعد التربسين – EDTA الحضانة ، يتم فحص الأنابيب عن حل ممكن من الامم المتحدة ومجموعات الخلية المختلطة. تتم إزالة أي مجموعات لاحظ استخدام الزجاج غرامة يميل باستور ماصة. بعد الغزل إلى أسفل (1.4 دورة في الدقيقة على جهاز الطرد المركزي لمدة 4 دقائق السريرية) ، هي خلايا hfRPE إعادة علقت في وسائل الإعلام RPE 15 ٪ ومن ثم وضعت في قوارير Primaria (على سبيل المثال : القط لم 08-772-45 ؛ فيشر العلمية ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا. ). يتم استبدال هذه الوسيلة بعد 1 اليوم مع 5 ٪ متوسطة RPE المحتوية على مصل ، وأجريت تغييرات لاحقة كل 2 إلى 3 أيام. بعد 3 إلى 4 أسابيع ، أصبح الخلايا الصباغية متكدسة وموحد. وبعد ذلك في trypsinized 0.25 ٪ التربسين – EDTA لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، وإعادة علقت في 15 ٪ المحتوية على مصل الثقافة المتوسطة RPE الخلية ، والمصنفة على إدراج ثقافة واضح في الخلية 150 إلى 200K الخلايا لكل بئر (Transwell ؛ كورنينج Costar ، كورنينج ، نيويورك) ، وذلك باستخدام إدراج قطرها 12 ملم ، المسام 0.4 ميكرون ، والأغشية البوليستر (على سبيل المثال : القط لم 07-200-161 ، فيشر العلمية)… قبل البذر ، والآبار المغلفة مع المصفوفة خارج الخلية البشرية (10 ميكروغرام في 150 HBSS ميكرولتر لكل بئر ، والقط لا 354237 ؛. العلوم البيولوجية دينار بحريني ، فرانكلين البحيرات ، ونيو جيرسي) ومملح مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة لمدة 2 ساعة. في بعض الحالات ، وقد تكرر هذا الإجراء trypsinization للمرة الثانية ، لجمع الخلايا التي لم تنفصل بعد trypsinization الأولى. البروتوكول نفسه (باستثناء طلاء مع ECM) تم استخدامه لخلايا الثقافة على قوارير لتوليد السكان P1 من الخلايا. تم استخدام هذه الخلايا في التجارب عندما كان لديهم مقاومة الأنسجة مجموعه ≥ 200 سم • Ω (2) وكانوا من ذوي البشرة بشكل موحد. الرجاء انقر هنا للحصول على أكبر الشكل 1 . 4. خطوة خطوة الإجراءات إعداد 12 لوحة جيدا مع حلول متعددة (على كل عين 4 آبار الحاجة) : إضافة 10X حل مضاد فطري المضادات الحيوية — 1 جيدا / العين إضافة PBS / HBSS حل لشطف — 2 الآبار / العين إضافة dispase الحل — 1 جيدا / العين تشريح إعداد طبق بتري بواسطة الإبر تفريغ التثبيت (5) وملئه مع HBSS فك العينين ووضعها بالمضادات الحيوية لمدة 3-5 مضاد فطري حل دقائق (المعد في الخطوة 1) شطف العينين في بئرين (المعد في الخطوة 1) مع برنامج تلفزيوني / HBSS ، ونقل بعد ذلك إلى تشريح الطبق. الإفراط في العضلات والأنسجة الضامة تقليم حول العين استخدام إبر 27G آمنة (دبوس وصولا الى قاعدة السيليكون) في تشريح العين طبق مواءمتها بطريقة القرنية حيث يواجه تهما تصل عقوبتها. باستخدام سكين sideport جعل شق تحت القرنية ، حيث قطع دائرية ستبدأ جعل خفض باستخدام مقص القزحية حول العين ، ثم باستخدام مقص قطع طريق نفس الزجاجي ورفع الجزء الأمامي من العين بعيدا. ملاحظة : في الخطوات 3-8 تجنب أي ضغط مفرط ميكانيكية لمقلة العين. نقل العين مفتوحة الى حل dispase (المعد في الخطوة 1) احتضان كأس العين 40-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 حل محل HBSS في تشريح طبق واحد جديد. نقل العين من حل لdispase طبق تشريح. العين الموقف في طبق بيتري (كوب مقلة العين التي تواجه متابعة) وآمنة مع اثنين من الإبر 27G. رفع بلطف فصل الشبكية جزئيا وباستخدام مقص قطع شبكية العين شبكية العين بعيدا عن العصب البصري. تجاهل الشبكية. باستخدام مقص القزحية جعل شق واحد من المحيط الخارجي للعين نحو العصب البصري. باستخدام كل خمسة إبر 27G تتسطح طبقة العين RPE صنع امتدت لطيف. شبكية العين باستخدام مقص جعل خفض دائرية حول العصب البصري فصل طبقة RPE من التعلق العصب البصري. ملاحظة : يمكن القيام الخطوات 13-17 مع التكبير منخفضة أو دون مجهر ستيريو ضبط stereomicroscope لتكبير 250xأو أكثر ، والعثور على حافة الورقة RPE قريبة من العصب البصري على طول قطع أدلى به مقص القزحية. باستخدام اثنين ملقط غشاء منفصلة RPE – بروك من طبقة الأنسجة المشيمية. قد يتطلب الأمر عدة محاولات للعثور على المنطقة الواقعة على طول الحافة حيث ربط RPE والمشيمية هو الأضعف. أوراق RPE المكان الى حل التربسين – EDTA الباردة في أنبوب 15 مل بعد أن يتم جمع RPE ، وكأب ، ونقل الأنابيب مع الأنسجة في التربسين – EDTA إلى حمام الماء ل15mins – 10 إلى 37 درجة مئوية. بعد 10 دقيقة من الحضانة ، هزة بقوة 15 مل أنابيب لفصل RPE في مجموعات صغيرة. إذا كان الانفصال ليست كاملة ، ومكان الأنابيب مرة أخرى إلى حمام الماء لمدة 5 دقائق. فحص أنابيب ممكن من الامم المتحدة ومجموعات حل الخلية المختلطة. يجب إزالة أي مجموعات وحظ استخدام الزجاج غرامة يميل باستور ماصة. تدور باستمرار (1.4 دورة في الدقيقة على جهاز الطرد المركزي لمدة 4 دقائق السريرية) hfRPE الخلايا ، وإزالة الخلايا وطاف اعادة تعليق في وسائل الاعلام RPE 15 ٪ (9 مجموع مل) 3 مل من وضع تعليق خلية في قوارير Primaria إضافة 2 مل من وسائل الاعلام RPE الطازجة بنسبة 15 ٪ ، دورق مكان في الحاضنة حتى اليوم التالي (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2) 5. ممثل النتائج وظيفية التحقق من خلية ثقافة hfRPE في التجارب السابقة استخدمنا هذه الثقافات الأولية لتحديد التعبير ، والاستقطاب وظيفة غشاء بروتينات البلازما النقل وتحديد مسارات محددة يشير إلى أن تنظيم وظيفة RPE 11/01 وهذه الخصائص هي التي تراكمت كما أنها توفر التحقق من صحة مجموعة من الخصائص التي يمكن تطبيقها لكل جيل الخلية. تلخيص التجارب دون تحديد البروتينات التي تحدد بطريق الظهارة نقل السوائل وسلامة المسار paracellular. وقد تم التحقق من صحة هذه التجارب في المختبر في نموذج حيواني من 6 إعادة إعادة الاتصال في شبكية العين. الشكل 2. تم الكشف عن CFTR في الخلايا hfRPE باستخدام الأغشية المخصب مقتطفات : توطين CFTR في الخلايا hfRPE اللوحة اليسرى العليا. M ، علامة الوزن الجزيئي ؛ حارة 1 ، ناضجة الكبرى (نطاق C) ، وغير ناضجة (العصابات A و B) لوحة مركز أقل : توطين المناعي من CFTR (بطاقة خضراء) لوحة أعلى اليمين : توسيع عرض المقطع العرضي للطائرة من خلال عرض ض. أقصى كثافة الإسقاط من خلال محور ض. ZO – 1 (وصفها بأنها حمراء) هي بمثابة علامة تقاطع ضيق ترسيم الجانبين قمية وbasolateral من RPE. دابي (الأزرق) تسميات نواة تقع بالقرب من الغشاء القاعدي. ZO – 1 يبدو أصفر ك / البرتقال ، حيث يتقاطع مع التسمية مضان أحمر أخضر من CFTR. الشكل 3. زيادة إضافة إلى حمام IFNγ القاعدية بطريق الظهارة نقل السوائل (J V) عبر أحادي الطبقة الأولية ، والخلايا المستزرعة hfRPE J v هي تآمر بوصفها وظيفة من الوقت في تتبع أعلى والسوائل الصافية : IFNγ بفعل التغيرات الفسيولوجية في hfRPE A. يشار إلى امتصاص (قمية لحمام القاعدية) من القيم الإيجابية ، ويتم رسم المحتملة بطريق الظهارة (TEP) ومجموع مقاومة الأنسجة (R T) بوصفها وظيفة من الوقت في آثار القاع. ب : منعت إضافة CFTRinh – 172 (5 ميكرون) إلى الحمام القاعدية للIFNγ – V حفز زيادة ياء. أدناه هو مثال على نموذج حيواني التجارب تؤكد hfRPE في نتائج المختبر. في هذه التجربة ، انخفض بشكل ملحوظ انفصال الشبكية مصطنع بعد إضافة IFNg على سطح العين الخارجي (الشكل 4 أ ، ب). يمكن أن يكون هذا التأثير سدت جزئيا عن طريق : (1) إضافة مانع المخيم (الشكل 4D) ، (2) منع تماما بعد إضافة حاصرات JAK cAMP في +. ويتم الحصول على الصور أدناه باستخدام أكتوبر الماسح الضوئي. الشكل 4 في التجارب المجراة انفصال الشبكية. وكانت لهذه الإجراءات في التجارب المجراة سبق وصفها بالتفصيل 6. في هذه التجارب ، تم إنشاء مفارز شبكية العين في الفئران عن طريق الحقن من 0،5-3 ميكرولتر من محلول PBS تعديل في الفضاء تحت الشبكية (SRS) ، وحدها أو مع مزيج من JAK – STAT ومثبطات PKA المسار. كان لكل تجربة فترة الرقابة الأولية من 40-70 دقيقة بعد إنشاء انفصال الشبكية. خلال هذا الوقت ، تم قياس معدل التغير في حجم فقاعة لضمان الاستقرار فقاعة. تم استخدام التصوير المقطعي التماسك البصري (معهد الفيزياء التطبيقية ، والأكاديمية الروسية للعلوم ، نيجني نوفغورود ، روسيا) لقياس الوقت من خلال تغيير الحجم في SRS. مسار الوقت لإعادة المرفق المجلدوقد تم قياس التغيير أوميا التصوير المقطعي التماسك البصري (أكتوبر). صور في الفترة من 4 أكتوبر تجارب مختلفة (لوحات على اليسار ؛ ميلادي) التي تدل على تغيير في أحجام مفرزة (الأسهم في A ، B ، D و) بعد إضافة IFNγ على السطح الأمامي لل40-70 دقيقة. لوحات A و B تبين أن زيادة IFNγ JV من معدل سيطرتها (≈ 2 سم 2 ميكرولتر • • ساعة -1) و 14 و 12 سم 2 ميكرولتر • • 1 ساعة ، على التوالي. بعد إضافة JAK – STAT المسار ومثبطات PKA (C و D) ، وIFNγ — خفضت بشكل كبير من معدلات امتصاص يسببها إلى 0.2 و 7.9 سم 2 ميكرولتر • • HR – 1 على التوالي. تشير الأسهم الحدود من فقاعة للمقارنة مع المساحة المحصورة داخل خط متقطع ، (المجلد البداية). الجانب الأيمن من الشكل : أعلى اللوحة ، ملخص لقياس معدلات JV من تجارب عدة ، وسط اللوحة ، فيلم ( انقر هنا ) ؛ اللوحة السفلى – 3D المقاطع من التجربة ملخصة في Pseudocolor باء باللون الأزرق يشير إلى مدى المكاني للانفصال في ور = 0 40 دقيقة بعد إضافة INFγ. وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لجمعية للبحوث في مجال الرؤية وبيان العيون. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان ، واستخدم من المعاهد الوطنية للصحة.
Discussion
في تجارب الحاضر ، ونحن تصف تعديلات إضافية من التقنيات التي تم نشرها مسبقا لدينا 3 تهدف إلى تبسيط الخطوات اللازمة لإنتاج متعددة الثقافات بما يتفق الأولية hfRPE مع ارتفاع عدد الخلايا المتاحة في العين. تم اختبار صارم كل تغيير في الإجراء الأصلي في علم وظائف الأعضاء وتجارب متعددة البيولوجيا الجزيئية للتأكد من أن التغييرات لم يعرض القطع الاثرية والتي يجري اختبارها باستمرار من قبل مختبرات أخرى كثيرة باستخدام هذه الخلايا. أخيرا ، أجريت تجارب إضافية إلى مقارنة في نتائج المختبر للاضطرابات مماثلة في النماذج الحيوانية.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مختبر أعضاء جيفري Adijanto ، بانزون تينا ، لى رونغ ، وان تشين تشانغ Congxiao ، زهاو جينغ تشى كوني ، ضياء عويس ، Strunnikova ناتاليا للمساعدة في تشخيص هذه الثقافات الخلية. شكر خاص الى زهاو جينغ تشى كوني ، وتينا بانزون لمساعدتهم في الحفاظ على مخزونات كبيرة من الثقافات الخلية.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للبرنامج البحوث الصحية الجماعية.
Materials
Instruments needed for dissection protocol
- Stereo Microscope – any available with working magnification x250 needed for dissection
- Dissecting dish – e.g. Kimble 100 x 20mm #23062 (one per dissection) any source
- Sylgard 184 – WPI Cat. #SYLG184*
* To prepare dissecting dish follow Sylgard 184 included mixing instructions, pour mixed liquid elastomer into Petri dish to form 5-8mm layer. Allow elastomer to cure for at least 24hrs. Dish with cured elastomer can be sterilized using 70% ethanol and reused multiple times (~100 times) - 27 G needles from B-D PrecissionGlide 1¼ length (5 per dissection) any source
- HBSS 1X Solution containing Ca and Mg salts – GIBCO Cat.#14025 500ml (good for multiple dissections)
- Iris scissors carbide serrated blade, curved – FST Cat.# 14559-11 (one)
- Retinal scissors – Katena Cat.#K4-5300 (one)
- Forceps – e.g. Dumont Tweezers #5 with polished tips from WPI Cat.#500085 (2 pieces)
- Sideport knife – Alcon, ClearCut 1mm, Dual Bevel, angled Cat.#8065921540
- Centrifuge tube 15ml – (one per eye) any source
- Pasteur glass pipette – (one per dissection) any source
- Plate 12 well (one per dissection) any source
- Primaria 25cm2 flask – (2-3 per eye) any source
Riferimenti
- Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells. Pigment Cell & Melanoma Research. , .
- Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).
- Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport. Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).
- Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: Building polarized tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).
- Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).
- Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).
- Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport. Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).
- Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).
- Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).
- Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB J. 24, (2010).
- Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium. J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).
- Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).
- Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium. J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).
- Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).
Tags
Retinal Pigment EpitheliumPhysiologyPathophysiologyCell Culture ProcedurePrimary Human Fetal Retinal Pigment EpitheliumHfRPE Cell CulturesPigmentationElectron MicroscopyApical Membrane MicrovilliTight Junction ProteinsEpithelial PolarityFunctionMammalian ModelsTherapeutic InterventionsAnimal ModelsEye DiseaseAbnormal Fluid AccumulationSubretinal SpacePhotoreceptor Outer SegmentsRetinal AttachmentsRPE/retina Interactions
Citazione di questo articolo
Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology. J. Vis. Exp. (45), e2032, doi:10.3791/2032 (2010).